Results and Discussion
Om de vorming en reparatie van AP sites als gevolg van base excision repair en spontane depurinatie/depyrimidinatie in vivo beter te begrijpen, maten we het aantal endogene AP sites in genomisch DNA geëxtraheerd uit verschillende weefsels van volwassen ratten en transplantaat-kwaliteit menselijke lever met behulp van de ASB assay (3). Het aantal endogene AP sites varieerde sterk tussen de weefsels (Fig. 1)⇓ maar niet binnen de weefsels. Het hoogste aantal AP sites werd gedetecteerd in de hersenen, met 30 AP sites per 106 nucleotiden, gevolgd door het hart en de dikke darm. Daarentegen vertoonden de lever, nieren en longen van ratten consequent het laagste aantal AP-sites (8-9 AP-sites per 106 nucleotiden). Het aantal endogene AP-sites in menselijke lever was vergelijkbaar met dat in rattenlever. Deze gegevens wijzen erop dat het aantal AP-sites per zoogdiercel onder normale fysiologische omstandigheden 50.000-200.000 bedraagt. Het steady-state aantal AP sites in genomisch DNA zou het evenwicht moeten weerspiegelen tussen de vorming en reparatie van de AP sites. Mogelijke interpretaties van het hogere aantal endogene AP-plaatsen in de hersenen zijn de volgende (a) hogere snelheid van depurinatie en/of endogene DNA adductvorming, resulterend in meer AP sites; (b) hogere activiteit van DNA glycosylase, resulterend in meer AP sites; (c) lagere activiteit van type II AP endonuclease, resulterend in accumulatie van AP sites; en (d) minder efficiëntie van dRp-ase of β-eliminatie, waardoor 5′-nicked AP sites overblijven.
Endogene AP sites in rat en menselijk weefsel. DNA werd bij 4°C geëxtraheerd uit intacte rattenweefsels en normale menselijke levers, en het aantal AP-sites werd gemeten met de ASB-test. A, typische röntgenfilm waarop endogene AP-sites van rattenweefsels te zien zijn. DNA (inclusief standaard DNA-monsters) werd op een NC-membraan geladen (1,5 μg per gleuf). B, scandensitometrische gegevens van endogene AP-plaatsen in ratten- en menselijke weefsels. Kolommen, gemiddelden van dubbele slots van vijf tot acht individuele monsters; bars, SD.
Het belangrijkste proces bij de reparatie van AP-plaatsen is de type II AP-endonuclease-/β-pol-afhankelijke route (7). Type II AP-endonuclease kan AP-locaties herkennen en de fosfodiësterbackbone onmiddellijk 5′ voor de laesies insnijden, waardoor een 3′-hydroxylgroep en een 5′-AP-locatieterminus overblijven (5). De 5′-dRp wordt vervolgens vrijgegeven, en het enkele nucleotide gat wordt opgevuld. Het is aangetoond dat aanzienlijke hoeveelheden van type II AP endonuclease aanwezig zijn in de kern van zoogdiercellen (8). Eerder toonden we aan dat de combinatie van ASB-assay en type II AP endonuclease of NaOH 3′ of 5′ splitsing van AP sites induceert, respectievelijk (3). Om de activiteit van AP endonuclease en dRp-ase in vivo te begrijpen, hebben we de AP site splitsing assay verder geoptimaliseerd. In dit experiment gebruikten we Exo III als het type II AP endonuclease om 3′-cleavage van AP sites te identificeren en putrescine om 5′-nicks te detecteren (Fig. 2)⇓. Om deze AP site splitsing assay te karakteriseren, incubeerden we DNA dat was voorbehandeld met MX om het aantal AP sites te verminderen tot 3,8 ± 0,5 AP sites per 106 nucleotiden (gemiddelde ± SD) met warmte en zuur buffer. Verschillende perioden van hitte/zuur incubatie induceren 11, 47, 115 en 320 AP-plaatsen per 106 nucleotiden. Een enkele behandeling met Exo III verminderde het aantal AP-plaatsen met 4-10 AP-plaatsen per 106 nucleotiden in elk DNA-monster, ongeacht het aanvankelijk aanwezige aantal (Fig. 3)⇓. Deze vermindering kan het gevolg zijn van de combinatie van enzymatische incisie aan de 5′-zijde door Exo III en niet-specifieke 3′ splitsing van AP-sites tijdens incubatie met Exo III. Deze niet-specifieke 3′ splitsing maakte een nauwkeurige kwantificering van het aantal 3′-gelinkte AP sites in DNA met deze assay onmogelijk. Daarentegen toonde putrescine behandeling geen reductie in het aantal AP sites. Na incubatie met Exo III gevolgd door putrescine was het aantal AP-sites gereduceerd tot het oorspronkelijke aantal AP-sites in kalfsthymus-DNA dat met MX was voorbehandeld. De splijtingsefficiëntie van AP-plaatsen door de combinatie van Exo III en putrescine was >99%.
Schema van AP site splitsing assay. Om de activiteiten van type II AP endonuclease, evenals dRp-ase in vivo beter te begrijpen, bepaalden we het bestaan van splitsingen aan de 5′ of 3′ kant van AP sites in genomisch DNA. Putrescine en Exo III (type II AP endonuclease) laten respectievelijk 3′-gespleten en 5′-gespleten AP sites achter. Voor intacte AP-sites zonder insnijding aan de 3′- en 5′-zijde van AP-sites kan de ASB-test theoretisch het oorspronkelijke aantal AP-sites detecteren na behandeling met Exo III of putrescine, omdat AP-sites op de DNA-backbone blijven na insnijding aan beide zijden van de fosfodiësterbinding die aan de AP-site grenst. De combinatie van Exo III en putrescine splitst echter zowel aan de 3′- als aan de 5′-zijde van de AP-locatie, waardoor de AP-locatie vrijkomt van de DNA-backbone. Dergelijke vrijgemaakte AP-locaties worden met deze assay niet gedetecteerd. Op basis van het aantal AP-locaties dat na deze splitsingsreactie op de DNA-backbone achterblijft, kan het aantal 5′- en 3′-gesplitste AP-locaties worden geschat. Als er 5′-gespleten AP-locaties in het DNA aanwezig zijn, kan de enkelvoudige behandeling met putrescine de 5′-gespleten AP-locaties vrijmaken door 3′-excisie van de AP-locaties. Evenzo kunnen 3′-gelinkte AP-sites in DNA worden vrijgemaakt door 5′-excisie met Exo III .
AP site cleavage assay van kalf thymus DNA behandeld met warmte/zuur buffer. Om de AP site splitsing assay te valideren, onderzochten we de effecten van Exo III en putrescine op intacte AP sites geïnduceerd in kalf thymus DNA. Het oorspronkelijke aantal AP-plaatsen in kalfsthymus-DNA werd gereduceerd met MX (CTD/MX). DNA werd vervolgens gedurende verschillende tijdsduur in een warmte/zuur-buffer geïncubeerd om verschillende aantallen intacte AP-sites te introduceren (-/-; Ref. 9). DNA werd geïncubeerd met Exo III en/of putrescine, en het aantal resterende AP-plaatsen in kalfsthymus-DNA werd gemeten met de ASB-test. Kolommen, gemiddelden van dubbele slots van drie afzonderlijke monsters; staven, SD. A, AP site-splitsingstest van DNA dat 115 AP sites per 106 nucleotiden bevat. B, samenvatting van AP site cleavage assay van DNA dat verschillende aantallen AP sites bevat.
We pasten deze assay toe op genomisch DNA dat was geëxtraheerd uit ratten- en menselijke weefsels om endogene AP sites te karakteriseren. De fracties van intacte en gesplitste AP-sites, en resterende aldehydische laesies zijn samengevat in Fig. 4⇓. DNA van ratten en menselijk weefsel werd geïncubeerd met Exo III gevolgd door putrescine om te onderzoeken of gedetecteerde laesies feitelijke AP-plaatsen waren. Na 5′ en 3′ splitsing van AP-plaatsen werden 1,5-2,2 residuele aldehydische laesies per 106 nucleotiden gedetecteerd. Deze gegevens geven aan dat de ASB-test de endogene AP-locaties correct meet. De resterende laesies kunnen te wijten zijn aan beperkingen van enzymreacties in de AP-site-splitsingstest en aan de aanwezigheid van endogene aldehydische basische laesies zoals formyluracil (10). Bovendien werd een gecombineerde fractie van 3′-gesplitste en intacte AP-locaties gedetecteerd bij ∼2-3 laesies per 106 nucleotiden in verschillende weefsels, wat ∼1/3-1/10 is van het totale aantal endogene AP-locaties. Om het aantal 5′-cleaved AP sites te onderzoeken, incubeerden we DNA met putrescine. De vermindering van AP sites door putrescine (het oorspronkelijke aantal AP sites min het aantal AP sites overgebleven na putrescine incubatie) vertegenwoordigde het aantal 5′-cleaved AP sites. In tegenstelling tot kalf thymus DNA voorbehandeld met warmte/zuur buffer, had genomisch DNA behandeld met putrescine een duidelijk verminderd aantal AP sites. Deze gegevens wijzen erop dat ongeveer tweederde of meer van de endogene AP-sites al aan de 5′-zijde van AP-sites in vivo worden gesplitst.
Samenvatting van AP site cleavage assay van rat en menselijk weefsel DNA. Het oorspronkelijke aantal AP-sites zoals beschreven in de legenda bij fig. 1B⇓ bestond uit 5′-gespleten, 3′-gespleten, intacte AP-sites, en resterende aldehydische laesies. Het aantal 5′-cleaved AP sites werd berekend als het oorspronkelijke aantal AP sites min het aantal AP sites die overbleven na behandeling met putrescine alleen. De gecombineerde fractie van 3′-gecleavede en intacte AP-sites was het verschil tussen putrescinebehandeling en de combinatiebehandeling van Exo III en putrescine. Resterende AP sites toonden het aantal ongekloven aldehydische laesies.
Na 5′ splitsing van de AP sites door type II AP endonuclease, moeten de gekliefde AP sites vervolgens worden vrijgemaakt van de DNA ruggengraat via excisie van 5′-dRp residuen. Dit vrijgaveproces wordt mogelijk uitgevoerd door dRp-ase via een hydrolytische reactie (11) of β-eliminatie (12) of via een endonucleolytisch enzym dat stroomafwaarts van 5′-dRp-moieties insnijdt (13). Het is aangetoond dat Xenopus en menselijke β-pol 5′-dRp vrijgeven door β-eliminatie (14). Met behulp van reparatie patch grootte hetzij in β-pol-null of -proficiënte cellen, is aangetoond dat een enkele kloof reparatie pathway was overheersend in β-pol-proficiënte cellen, maar niet in β-pol-null cellen (15). Bovendien versnelt de interactie tussen menselijk AP endonuclease en β-pol het vrijkomen van 5′-dRp residuen in vitro (16). Echter, de reparatie-efficiëntie van 5′-dRp moieties is niet goed gekarakteriseerd in cellen of in vivo. Met behulp van celvrije extracten van gist is gevonden dat de verwerking van de 5′-dRp mootjes een snelheidslimiterende stap is tijdens base-excisie herstel van uracil-bevattend DNA (17). Bovendien werd de katalytische efficiëntie van β-pol om 5′-dRp te verwijderen onderzocht (18). Interessant genoeg was de Kcat van 5′- dRp-ase activiteit van β-pol ∼100-voudig lager dan de Kcat van AP endonuclease. Deze studie toont een duidelijke persistentie aan van 5′-geïnciseerde AP sites in rat en menselijk weefsel. Deze gegevens suggereren dat incisie door AP endonuclease en de daaropvolgende vrijgave van 5′-dRp residuen mogelijk niet efficiënt gekoppeld zijn op een basaal niveau in vivo en dat het herstelproces van 5′-dRp een van de snel beperkende stappen in base-excisie reparatie kan zijn.
In de vorige studie (3), toonden we aan dat spontane depurinatie optrad bij 1,5 AP sites per 106 nucleotiden per dag onder fysiologische omstandigheden. Om te testen of hitte-labiele DNA adducten zoals N3- en N7-alkyl purines de bron waren van het hogere aantal endogene AP plaatsen in de hersenen, werd een depurinatie assay uitgevoerd in hersenen en lever DNA. Er werd echter geen verschil waargenomen in hersenen en lever (gegevens niet weergegeven). Daarom is het mogelijk dat de stabiele toestand van endogene AP-plaatsen niet te wijten is aan labiele basenlaesies. Een van de meest belangrijke en overvloedige endogene DNA laesies is oxidatieve DNA base schade. Er is gerapporteerd dat de steady state van 5-hydroxycytosine in rattenhersenen ∼2-voudig hoger is dan die in rattenlever (19). Dergelijke oxidatieve pyrimidine basen worden gerepareerd door End III, waardoor AP-plaatsen op de DNA-backbone achterblijven. Om te onderzoeken of oxidatieve stress gerelateerd kan worden aan het steady-state aantal AP sites in DNA, werden End III-gevoelige sites gekwantificeerd met behulp van de combinatie van de ASB-assay en E. coli End III. Het aantal End III-gevoelige plaatsen was driemaal hoger in de hersenen (14 laesies per 106 nucleotiden) in vergelijking met andere weefsels (4-5 laesies per 106 nucleotiden). Onlangs is het humane homoloog van het End III-gen (hNTH1) gekloond en gekarakteriseerd (20). De mRNA-expressie van dit gen varieert tussen organen in een patroon dat overeenkomt met het aantal endogene AP-plaatsen (20). De meeste DNA-glycosylases die betrokken zijn bij het herstel van geoxideerde basen bezitten AP lyase-activiteit, die de 3′-zijde van AP sites klieft. Daarom zouden endogene 5′ AP sites niet afkomstig zijn van de splitsingen van geoxideerde basen door dergelijke DNA glycosylases. Een inleidend experiment toonde aan dat waterstofperoxide met FeSO4 direct 5′-gespleten AP sites in kalf thymus DNA induceerde zonder enzymen (gegevens niet getoond). Deze studies suggereren dat oxidatieve stress één van de factoren zou kunnen zijn die verantwoordelijk zijn voor de steady state van AP sites met 5′ splitsing.
Wij verwachtten oorspronkelijk lage aantallen endogene AP sites in genomisch DNA te vinden vanwege hun toxiciteit en mutageniciteit. Echter, deze studie toont aan dat de steady state van AP sites ∼1 laesie per 105 nucleotiden in genomisch DNA is. Hoewel AP-locaties voortdurend worden gerepareerd, zal de fractie van AP-locaties die aan reparatie ontsnapt waarschijnlijk bijdragen aan mutaties, chromosoomafwijkingen en transcriptiefouten die geassocieerd kunnen worden met spontane leeftijdsgebonden ziekten zoals kanker en degeneratieve aandoeningen.