Resultados y discusión
Para comprender mejor la formación y reparación de los sitios AP resultantes de la reparación por escisión de bases y de la depuración/despirimidación espontánea in vivo, medimos el número de sitios AP endógenos en el ADN genómico extraído de varios tejidos de ratas adultas y de hígado humano de calidad de trasplante utilizando el ensayo ASB (3). El número de sitios AP endógenos varió ampliamente entre los tejidos (Fig. 1)⇓ pero no dentro de los tejidos. El mayor número de sitios AP se detectó en el cerebro, con 30 sitios AP por cada 106 nucleótidos, seguido por el corazón y el colon. Por el contrario, el hígado, el riñón y el pulmón de rata mostraron sistemáticamente el menor número de sitios AP (8-9 sitios AP por 106 nucleótidos). El número de sitios AP endógenos en el hígado humano era comparable al del hígado de rata. Estos datos indican que los sitios AP persisten en 50.000-200.000 lesiones por célula de mamífero en condiciones fisiológicas normales. El número de sitios AP en estado estable en el ADN genómico debería reflejar el equilibrio entre la formación y la reparación de los sitios AP. Las posibles interpretaciones del mayor número de sitios AP endógenos en el cerebro son las siguientes (a) una mayor tasa de depuración y/o formación de aductos de ADN endógeno, lo que da lugar a más sitios AP; (b) una mayor actividad de la ADN glicosilasa, que induce más sitios AP; (c) una menor actividad de la endonucleasa AP de tipo II, que provoca la acumulación de sitios AP; y (d) una menor eficiencia de la dRp-asa o de la β-eliminación, lo que deja sitios AP de 5′-nick.
Sitios AP endógenos en tejidos de rata y humanos. El ADN se extrajo a 4°C de tejidos de rata intactos y de hígados humanos normales, y el número de sitios AP se midió mediante el ensayo ASB. A, película típica de rayos X que muestra los sitios de AP endógenos de los tejidos de rata. El ADN (incluidas las muestras de ADN estándar) se cargó en una membrana NC (1,5 μg por ranura). B, datos densitométricos de barrido de los sitios de AP endógenos en los tejidos de rata y humanos. Columnas, medias de ranuras duplicadas de cinco a ocho muestras individuales; barras, SD.
El proceso principal en la reparación de sitios AP es la vía dependiente de la endonucleasa AP tipo II/β-pol (7). La endonucleasa AP de tipo II puede reconocer los sitios AP e incidir en la espina dorsal del fosfodiéster inmediatamente 5′ a las lesiones, dejando un grupo 3′-hidroxilo y una terminación del sitio 5′-AP (5). La 5′-dRp se libera posteriormente y se rellena el hueco de un solo nucleótido. Se ha demostrado que cantidades significativas de endonucleasa AP de tipo II están presentes en el núcleo de las células de mamíferos (8). Anteriormente, demostramos que la combinación del ensayo ASB y la endonucleasa AP de tipo II o el NaOH induce la escisión 3′ o 5′ de los sitios AP, respectivamente (3). Para comprender la actividad de la endonucleasa AP y la dRp-asa in vivo, optimizamos aún más el ensayo de escisión de sitios AP. En este experimento, utilizamos Exo III como endonucleasa AP de tipo II para identificar la escisión de 3′ sitios AP y putrescina para detectar 5′-nicks (Fig. 2)⇓. Para caracterizar este ensayo de escisión de sitios AP, incubamos ADN que había sido pretratado con MX para reducir el número de sitios AP a 3,8 ± 0,5 sitios AP por 106 nucleótidos (media ± SD) con tampón de calor y ácido. Varios períodos de incubación con calor/ácido indujeron 11, 47, 115 y 320 sitios AP por 106 nucleótidos. Un único tratamiento de Exo III redujo el número de sitios AP en 4-10 sitios AP por 106 nucleótidos en cada muestra de ADN, independientemente del número inicial presente (Fig. 3)⇓. Esta reducción puede deberse a la combinación de la incisión enzimática en el lado 5′ por parte de Exo III y la escisión 3′ no específica de los sitios AP durante la incubación con Exo III. Esta escisión 3′ inespecífica impidió la cuantificación precisa del número de sitios AP 3′-nicados en el ADN con este ensayo. Por el contrario, el tratamiento con putrescina no mostró ninguna reducción en el número de sitios AP. Tras la incubación con Exo III seguida de putrescina, el número de sitios AP se redujo al número original de sitios AP en el ADN de timo de ternera pretratado con MX. La eficiencia de escisión de los sitios AP por la combinación de Exo III y putrescina fue de >99%.
Esquema del ensayo de escisión de sitios AP. Para comprender mejor las actividades de la endonucleasa AP de tipo II, así como de la dRp-asa in vivo, determinamos la existencia de cortes en el lado 5′ o 3′ de los sitios AP en el ADN genómico. La putrescina y la Exo III (endonucleasa AP de tipo II) dejan sitios AP clivados en 3′ y 5′, respectivamente. Para los sitios AP intactos sin incisión en los lados 3′ y 5′ de los sitios AP, el ensayo ASB puede detectar teóricamente el número original de sitios AP tras el tratamiento con Exo III o putrescina porque los sitios AP permanecen en la columna vertebral del ADN tras la incisión en cualquier lado del enlace fosfodiéster adyacente al sitio AP. Sin embargo, la combinación de Exo III y putrescina escinde tanto el lado 3′ como el 5′ del sitio AP, lo que resulta en la liberación del sitio AP de la columna vertebral del ADN. Estos sitios AP liberados no son detectados por este ensayo. Sobre la base del número de sitios AP que quedan en la columna vertebral del ADN después de esta reacción de escisión, se puede estimar el número de sitios AP escindidos en 5′ y 3′. Si en el ADN hay sitios AP escindidos en 5′, el tratamiento único con putrescina puede liberar los sitios AP escindidos en 5′ mediante la escisión en 3′ de los sitios AP . Del mismo modo, los sitios AP 3′-nicados en el ADN pueden ser liberados por 5′-excisión utilizando Exo III .
Ensayo de escisión del sitio AP del ADN del timo de ternera tratado con tampón de calor/ácido. Para validar el ensayo de escisión de sitios AP, examinamos los efectos de Exo III y putrescina en los sitios AP intactos inducidos en el ADN de timo de ternera. El número original de sitios AP en el ADN de timo de ternera fue reducido por MX (CTD/MX). A continuación, el ADN se incubó en un tampón de calor/ácido durante diferentes periodos de tiempo para introducir diferentes números de sitios AP intactos (-/-; Ref. 9). El ADN se incubó con Exo III y/o putrescina, y el número de sitios AP restantes en el ADN de timo de ternera se midió mediante el ensayo ASB . Columnas, medias de ranuras duplicadas de tres muestras individuales; barras, SD. A, ensayo de escisión de sitios AP del ADN que contiene 115 sitios AP por 106 nucleótidos. B, resumen del ensayo de escisión de sitios AP del ADN que contiene diferentes números de sitios AP.
Aplicamos este ensayo al ADN genómico extraído de tejidos de rata y humanos para caracterizar los sitios AP endógenos. Las fracciones de sitios AP intactos y escindidos, y las lesiones aldehídicas residuales se resumen en la Fig. 4⇓. El ADN de tejido de rata y humano se incubó con Exo III seguido de putrescina para examinar si las lesiones detectadas eran sitios AP reales. Después de la escisión en 5′ y 3′ de los sitios AP, se detectaron 1,5-2,2 lesiones aldehídicas residuales por cada 106 nucleótidos. Estos datos indican que el ensayo ASB mide correctamente los sitios AP endógenos. Las lesiones residuales pueden deberse a las limitaciones de las reacciones enzimáticas en el ensayo de escisión de sitios AP, así como a la presencia de lesiones de bases aldehídicas endógenas como el formiluracilo (10). Además, se detectó una fracción combinada de sitios AP 3′-cleaved e intactos de ∼2-3 lesiones por 106 nucleótidos en diferentes tejidos, que es ∼1/3-1/10 del número total de sitios AP endógenos. Para examinar el número de sitios AP clareados en 5′, incubamos el ADN con putrescina. La reducción de los sitios AP por la putrescina (el número original de sitios AP menos el número de sitios AP que quedan después de la incubación con putrescina) representó el número de sitios AP 5′-cleaved. En contraste con el ADN de timo de ternera pretratado con tampón de calor/ácido, el ADN genómico tratado con putrescina tenía un número notablemente reducido de sitios AP. Estos datos indican que aproximadamente dos tercios o más de los sitios AP endógenos ya están escindidos en el lado 5′ de los sitios AP in vivo.
Resumen del ensayo de escisión de sitios AP de ADN de tejido de rata y humano. El número original de sitios AP como se describe en la leyenda de la Fig. 1B⇓ consistió en sitios AP 5′-cleaved, 3′-cleaved, intactos y lesiones aldehídicas residuales. El número de sitios AP 5′-cleaved se calculó como el número original de sitios AP menos el número de sitios AP que quedaron después del tratamiento con putrescina sola. La fracción combinada de sitios AP 3′-cleaved e intactos fue la diferencia entre el tratamiento con putrescina y el tratamiento combinado de Exo III y putrescina. Los sitios AP residuales mostraron el número de lesiones aldehídicas sin escindir.
Después de la escisión en 5′ de los sitios AP por la endonucleasa AP de tipo II, los sitios AP incisos tienen que ser liberados posteriormente de la columna vertebral del ADN a través de la escisión de los residuos 5′-dRp. Este proceso de liberación es posiblemente realizado por la dRp-asa a través de una reacción hidrolítica (11) o β-eliminación (12) o a través de una enzima endonucleolítica que incide aguas abajo de los restos de 5′-dRp (13). Se ha demostrado que el β-pol de Xenopus y el humano liberan 5′-dRp por β-eliminación (14). Utilizando el tamaño del parche de reparación en células β-pol-nulas o -proficientes, se ha demostrado que una única vía de reparación de huecos era predominante en las células β-pol-proficientes pero no en las β-pol-nulas (15). Además, la interacción entre la endonucleasa AP humana y el β-pol acelera la liberación de residuos de 5′-dRp in vitro (16). Sin embargo, la eficiencia de reparación de los restos de 5′-dRp no ha sido bien caracterizada en células o in vivo. Utilizando extractos libres de células de levadura, se ha descubierto que el procesamiento de los restos de 5′-dRp es un paso limitante durante la reparación por escisión de bases del ADN que contiene uracilo (17). Además, se examinó la eficiencia catalítica de β-pol para eliminar 5′-dRp (18). Curiosamente, el Kcat de la actividad 5′-dRp-asa de β-pol fue ∼100 veces menor que el Kcat de la endonucleasa AP. Este estudio demuestra una clara persistencia de los sitios 5′-incisos de AP en los tejidos de rata y humanos. Estos datos sugieren que la incisión por la endonucleasa AP y la subsiguiente liberación de residuos de 5′-dRp pueden no estar eficientemente unidas a un nivel basal in vivo y que el proceso de reparación de 5′-dRp puede ser uno de los pasos limitantes de la tasa de reparación de escisión de bases.
En el estudio anterior (3), demostramos que la depuración espontánea se producía a razón de 1,5 sitios AP por cada 106 nucleótidos por día en condiciones fisiológicas. Para comprobar si los aductos de ADN termolábiles, como las purinas N3- y N7-alkyl, eran la fuente del mayor número de sitios AP endógenos en el cerebro, se realizó un ensayo de depuración en el ADN cerebral y hepático. Sin embargo, no se observaron diferencias entre el cerebro y el hígado (datos no mostrados). Por lo tanto, el estado estable de los sitios AP endógenos puede no deberse a lesiones de bases lábiles. Una de las lesiones endógenas del ADN más importantes y abundantes es el daño oxidativo de las bases del ADN. Se ha informado de que el estado estable de la 5-hidroxicitosina en el cerebro de rata es ∼2 veces mayor que en el hígado de rata (19). Estas bases pirimidínicas oxidadas son reparadas por el extremo III, dejando sitios AP en la columna vertebral del ADN. Para examinar si el estrés oxidativo podría estar relacionado con el número de sitios AP en estado estacionario en el ADN, se cuantificaron los sitios sensibles al End III utilizando la combinación del ensayo ASB y el End III de E. coli. El número de sitios sensibles al End III era tres veces mayor en el cerebro (14 lesiones por 106 nucleótidos) en comparación con otros tejidos (4-5 lesiones por 106 nucleótidos). Recientemente, se ha clonado y caracterizado el homólogo humano del gen End III (hNTH1) (20). La expresión del ARNm de este gen varía entre los órganos en un patrón que se corresponde con el número de sitios AP endógenos (20). La mayoría de las glicosilasas de ADN que participan en la reparación de bases oxidadas poseen actividad de liasa AP, que escinde el lado 3′ de los sitios AP. Por lo tanto, los sitios AP endógenos 5′ no se derivarían de las escisiones de las bases oxidadas por dichas glicosilasas de ADN. Un experimento preliminar demostró que el peróxido de hidrógeno con FeSO4 indujo directamente sitios AP clivados en 5′ en el ADN del timo de ternera sin ninguna enzima (datos no mostrados). Estos estudios sugieren que el estrés oxidativo podría ser uno de los factores responsables del estado estable de los sitios AP con escisión 5′.
En un principio esperábamos encontrar un bajo número de sitios AP endógenos en el ADN genómico debido a su toxicidad y mutagenicidad. Sin embargo, este estudio muestra que el estado estable de los sitios AP es de ∼1 lesión por cada 105 nucleótidos en el ADN genómico. Aunque los sitios AP se reparan constantemente, es probable que la fracción de sitios AP que escapa a la reparación contribuya a las mutaciones, las aberraciones cromosómicas y los errores de transcripción que pueden estar asociados a enfermedades espontáneas relacionadas con la edad, como el cáncer y los trastornos degenerativos.