Resultat och diskussion
För att bättre förstå bildandet och reparationen av AP-sidor till följd av reparation av basexcisionsreparation och spontan depurinering/depyrimidinering in vivo, mätte vi antalet endogena AP-platser i genomiskt DNA som extraherats från olika vävnader från vuxna råttor och mänsklig lever av transplantationskvalitet med hjälp av ASB-analysen (3). Antalet endogena AP-platser varierade kraftigt mellan olika vävnader (fig. 1)⇓ men inte inom vävnader. Det högsta antalet AP-platser upptäcktes i hjärnan, med 30 AP-platser per 106 nukleotider, följt av hjärtat och tjocktarmen. Däremot uppvisade råttlever, njure och lunga konsekvent det lägsta antalet AP-platser (8-9 AP-platser per 106 nukleotider). Antalet endogena AP-platser i mänsklig lever var jämförbart med antalet i råttlever. Dessa uppgifter tyder på att AP-platser finns kvar på 50 000-200 000 lesioner per däggdjurscell under normala fysiologiska förhållanden. Det stabila antalet AP-platser i genomiskt DNA bör återspegla balansen mellan bildning och reparation av AP-platser. Möjliga tolkningar av det högre antalet endogena AP-platser i hjärnan är följande: (a) Högre depurineringshastighet och/eller bildning av endogena DNA-addukt, vilket resulterar i fler AP-platser, b) högre aktivitet av DNA-glykosylas, vilket inducerar fler AP-platser, c) lägre aktivitet av AP-endonukleas av typ II, vilket leder till ackumulering av AP-platser, och d) lägre effektivitet hos dRp-as eller β-elimination, vilket lämnar 5′-nicked AP-platser.
Endogena AP-platser i vävnader från råtta och människa. DNA extraherades vid 4 °C från intakta vävnader från råttor och normal mänsklig lever, och antalet AP-platser mättes med ASB-analysen. A, typisk röntgenfilm som visar endogena AP-platser i råttvävnad. DNA (inklusive standard-DNA-prover) laddades på ett NC-membran (1,5 μg per spår). B, skanningdensitometriska data för endogena AP-platser i vävnader från råttor och människor. Kolumner, medelvärden från dubbla slots av fem till åtta individuella prover; staplar, SD.
Den viktigaste processen vid reparation av AP-platser är den typ II AP-endonukleas-/β-pol-beroende vägen (7). Typ II AP-endonukleas kan känna igen AP-platser och skära in fosfodiester-ryggraden omedelbart 5′ till lesionerna, vilket lämnar en 3′-hydroxylgrupp och 5′-AP-platsens terminus (5). 5′-dRp frigörs därefter och den enskilda nukleotidluckan fylls. Det har visats att betydande mängder AP-endonukleas av typ II finns i kärnan i däggdjursceller (8). Vi har tidigare visat att kombinationen av ASB-analys och typ II AP-endonukleas eller NaOH inducerar 3′- eller 5′-klyvning av AP-platser (3). För att förstå aktiviteten hos AP-endonukleas och dRp-as in vivo optimerade vi ytterligare AP-site cleavage-assayet. I detta experiment använde vi Exo III som AP-endonukleas av typ II för att identifiera 3′-spaltning av AP-platser och putrescin för att upptäcka 5′-klyvningar (fig. 2)⇓. För att karakterisera detta test för klyvning av AP-platser inkuberade vi DNA som hade förbehandlats med MX för att minska antalet AP-platser till 3,8 ± 0,5 AP-platser per 106 nukleotider (medelvärde ± SD) med värme- och syrabuffert. Olika perioder av värme/syrainkubation gav upphov till 11, 47, 115 och 320 AP-platser per 106 nukleotider. En enda behandling med Exo III minskade antalet AP-platser med 4-10 AP-platser per 106 nukleotider i varje DNA-prov, oavsett det ursprungliga antalet närvarande (fig. 3)⇓. Denna minskning kan bero på kombinationen av enzymatisk snittning på 5′-sidan av Exo III och ospecifik 3′-klyvning av AP-platser under inkubation med Exo III. Denna ospecifika 3′-klyvning omöjliggjorde en exakt kvantifiering av antalet 3′-nickade AP-platser i DNA med denna analys. Däremot visade putrescinbehandling ingen minskning av antalet AP-platser. Efter inkubation med Exo III följt av putrescin reducerades antalet AP-platser till det ursprungliga antalet AP-platser i kalvthymus-DNA som förbehandlats med MX. Klyvningseffektiviteten av AP-platser genom kombinationen av Exo III och putrescin var >99%.
Skema för analys av klyvning av AP-platser. För att bättre förstå aktiviteterna hos typ II AP-endonukleas och dRp-as in vivo bestämde vi förekomsten av klyvningar på 5′- eller 3′-sidan av AP-platser i genomiskt DNA. Putrescin och Exo III (typ II AP-endonukleas) lämnar 3′-spaltade respektive 5′-spaltade AP-platser. För intakta AP-platser utan snitt på 3′- och 5′-sidan av AP-platser kan ASB-analysen teoretiskt sett detektera det ursprungliga antalet AP-platser efter behandling med antingen Exo III eller putrescin, eftersom AP-platserna finns kvar på DNA-ryggen efter snitt på endera sidan av fosfodiesterbindningen i anslutning till AP-platsen. Kombinationen av Exo III och putrescin klyver dock både 3′- och 5′-sidorna av AP-platsen, vilket resulterar i att AP-platsen frigörs från DNA-ryggen. Sådana frigjorda AP-platser upptäcks inte med denna analys. På grundval av antalet AP-platser som finns kvar på DNA-ryggen efter denna klyvningsreaktion kan antalet 5′- och 3′-klyvda AP-platser uppskattas. Om 5′-spaltade AP-platser finns i DNA kan en enkel behandling med putrescin frigöra de 5′-nickade AP-platserna genom 3′-spaltning av AP-platserna . På samma sätt kan 3′-nickade AP-platser i DNA frigöras genom 5′-excision med hjälp av Exo III .
AP-site cleavage assay av kalvthymus-DNA som behandlats med värme/syrabuffert. För att validera testet för klyvning av AP-platser undersökte vi effekterna av Exo III och putrescin på intakta AP-platser som inducerats i kalvthymus-DNA. Det ursprungliga antalet AP-platser i kalvtyms-DNA reducerades med MX (CTD/MX). DNA inkuberades sedan i värme/syrabuffert under olika lång tid för att införa olika antal intakta AP-platser (-/-; Ref. 9). DNA inkuberades med Exo III och/eller putrescin och antalet återstående AP-platser i kalvtyms-DNA mättes med ASB-analysen. Kolumner, medelvärden från duplikatslots av tre individuella prover; staplar, SD. A, analys av klyvning av AP-platser i DNA som innehåller 115 AP-platser per 106 nukleotider. B, sammanfattning av AP-site cleavage assay av DNA som innehåller olika antal AP sites.
Vi tillämpade detta assay på genomiskt DNA som extraherats från vävnader från råtta och människa för att karakterisera endogena AP sites. Fraktionerna av intakta och klyvda AP-platser och kvarvarande aldehydiska lesioner sammanfattas i figur 4⇓. DNA från rått- och människovävnad inkuberades med Exo III följt av putrescin för att undersöka om upptäckta lesioner var faktiska AP-platser. Efter 5′- och 3′-klyvning av AP-platser upptäcktes 1,5-2,2 kvarvarande aldehydiska lesioner per 106 nukleotider. Dessa uppgifter visar att ASB-analysen korrekt mäter endogena AP-platser. De kvarvarande lesionerna kan bero på begränsningar i enzymreaktionerna i AP-platsens klyvningsanalys samt på förekomsten av endogena aldehydiska baslesioner, t.ex. formyluracil (10). Dessutom upptäcktes en kombinerad fraktion av 3′-spaltade och intakta AP-platser på ∼2-3 lesioner per 106 nukleotider i olika vävnader, vilket är ∼1/3-1/10 av det totala antalet endogena AP-platser. För att undersöka antalet 5′-spaltade AP-platser inkuberade vi DNA med putrescin. Minskningen av AP-platser genom putrescin (det ursprungliga antalet AP-platser minus det antal AP-platser som återstod efter putrescininkubationen) representerade antalet 5′-klövade AP-platser. I motsats till kalvthymus-DNA som förbehandlats med värme/syrabuffert hade genomiskt DNA som behandlats med putrescin ett markant minskat antal AP-platser. Dessa data tyder på att ungefär två tredjedelar eller mer av de endogena AP-platserna redan klyvs på 5′-sidan av AP-platserna in vivo.
Sammanfattning av analysen av klyvning av AP-platser i DNA från råttor och mänsklig vävnad. Det ursprungliga antalet AP-platser enligt beskrivningen i legenden till figur 1B⇓ bestod av 5′-spaltade, 3′-spaltade, intakta AP-platser och kvarvarande aldehydiska lesioner. Antalet 5′-klövade AP-platser beräknades som det ursprungliga antalet AP-platser minus det antal AP-platser som fanns kvar efter behandling med enbart putrescin. Den kombinerade fraktionen av 3′-klövade och intakta AP-platser var skillnaden mellan behandling med putrescin och kombinationsbehandling med Exo III och putrescin. Resterande AP-platser visade antalet oskilda aldehydiska lesioner.
Efter 5′-klyvning av AP-platserna med AP-endonukleas av typ II måste de inskurna AP-platserna därefter frigöras från DNA-ryggen via excision av 5′-dRp-rester. Denna frisättningsprocess kan eventuellt utföras av dRp-as genom hydrolytisk reaktion (11) eller β-eliminering (12) eller genom ett endonukleolytiskt enzym som skär nedströms från 5′-dRp-grupper (13). Det har visats att Xenopus och humant β-pol frigör 5′-dRp genom β-eliminering (14). Genom att använda reparationsfläcksstorlek antingen i β-pol-null eller -proficient celler har det visats att en enda reparationsväg för gapreparation var dominerande i β-pol-proficient celler men inte i β-pol-null celler (15). Dessutom påskyndar interaktionen mellan humant AP-endonukleas och β-pol frisättningen av 5′-dRp-rester in vitro (16). Reparationseffektiviteten hos 5′-dRp-rester har dock inte karakteriserats väl i celler eller in vivo. Med hjälp av cellfria extrakt från jäst har man funnit att bearbetningen av 5′-dRp-partierna är ett hastighetsbegränsande steg under basexcisionsreparation av uracil-innehållande DNA (17). Vidare undersöktes den katalytiska effektiviteten hos β-pol för att avlägsna 5′-dRp (18). Intressant nog var Kcat för 5′-dRp-asaktiviteten hos β-pol ∼100 gånger lägre än Kcat för AP-endonukleas. Denna studie visar en tydlig persistens av 5′-inciserade AP-platser i vävnader från råttor och människor. Dessa data tyder på att incision genom AP-endonukleas och den efterföljande frisättningen av 5′-dRp-rester kanske inte är effektivt sammankopplade på en basal nivå in vivo och att reparationsprocessen av 5′-dRp kan vara ett av de hastighetsbegränsande stegen i basexcisionsreparation.
I den tidigare studien (3) visade vi att spontan depurinering inträffade vid 1,5 AP-platser per 106 nukleotider per dag under fysiologiska förhållanden. För att testa om värmelabila DNA-addukter som N3- och N7-alkylpuriner var källan till det högre antalet endogena AP-platser i hjärnan utfördes en depurineringsanalys i hjärn- och lever-DNA. Ingen skillnad observerades dock i hjärna och lever (data visas inte). Därför kan det stabila tillståndet av endogena AP-platser inte bero på labila baslesioner. En av de viktigaste och mest förekommande endogena DNA-skadorna är oxidativ DNA-basskada. Det har rapporterats att 5-hydroxycytosinets steady state i råtthjärna är ∼2 gånger högre än i råttlever (19). Sådana oxidativa pyrimidinbaser repareras av End III och lämnar AP-platser på DNA-ryggen. För att undersöka om oxidativ stress kan relateras till steady-state antalet AP-platser i DNA kvantifierades End III-känsliga platser med hjälp av kombinationen av ASB-analysen och E. coli End III. Antalet End III-känsliga platser var tre gånger högre i hjärnan (14 skador per 106 nukleotider) jämfört med andra vävnader (4-5 skador per 106 nukleotider). Nyligen har den mänskliga homologen till End III-genen (hNTH1) klonats och karakteriserats (20). Det mRNA-uttrycket av denna gen varierar mellan olika organ enligt ett mönster som motsvarar antalet endogena AP-platser (20). De flesta DNA-glykosylaser som deltar i reparationen av oxiderade baser har AP-lyasaktivitet, som klyver 3′-sidan av AP-platser. Därför skulle endogena 5′ AP-platser inte härröra från sådana DNA-glykosylasers klyvning av oxiderade baser. Ett preliminärt experiment visade att väteperoxid med FeSO4 direkt inducerade 5′-spaltade AP-platser i kalvthymus-DNA utan några enzymer (data inte visad). Dessa studier tyder på att oxidativ stress kan vara en av de faktorer som är ansvariga för det stabila tillståndet för AP-platser med 5′-klyvning.
Vi förväntade oss ursprungligen att hitta ett lågt antal endogena AP-platser i genomiskt DNA på grund av deras toxicitet och mutagenicitet. Den här studien visar emellertid att det stabila tillståndet för AP-platser är ∼1 lesion per 105 nukleotider i genomiskt DNA. Även om AP-platser ständigt repareras är det troligt att den del av AP-platserna som inte repareras bidrar till mutationer, kromosomavvikelser och transkriptionsfel som kan vara förknippade med spontana åldersrelaterade sjukdomar som cancer och degenerativa sjukdomar.