Ergebnisse und Diskussion
Um die Bildung und Reparatur von AP-Stellen infolge von Basenexzisionsreparatur und spontaner Depurinierung/Depyrimidinierung in vivo besser zu verstehen, haben wir die Anzahl der endogenen AP-Stellen in genomischer DNA, die aus verschiedenen Geweben erwachsener Ratten und menschlicher Leber in Transplantatqualität extrahiert wurde, mit dem ASB-Assay gemessen (3). Die Anzahl der endogenen AP-Stellen variierte stark zwischen den einzelnen Geweben (Abb. 1), jedoch nicht innerhalb der Gewebe. Die höchste Anzahl von AP-Stellen wurde im Gehirn mit 30 AP-Stellen pro 106 Nukleotide festgestellt, gefolgt von Herz und Dickdarm. Im Gegensatz dazu wiesen Rattenleber, -niere und -lunge durchweg die geringste Anzahl von AP-Stellen auf (8-9 AP-Stellen pro 106 Nukleotide). Die Zahl der endogenen AP-Stellen in der menschlichen Leber war mit der in der Rattenleber vergleichbar. Diese Daten weisen darauf hin, dass unter normalen physiologischen Bedingungen 50.000-200.000 AP-Stellen pro Säugetierzelle vorhanden sind. Die Steady-State-Anzahl der AP-Stellen in der genomischen DNA sollte das Gleichgewicht zwischen der Bildung und der Reparatur der AP-Stellen widerspiegeln. Die höhere Anzahl endogener AP-Stellen im Gehirn kann wie folgt interpretiert werden: (a) höhere Rate der Depurinierung und/oder der Bildung endogener DNA-Addukte, was zu mehr AP-Stellen führt; (b) höhere Aktivität der DNA-Glykosylase, was zu mehr AP-Stellen führt; (c) geringere Aktivität der Typ-II-AP-Endonuklease, was zu einer Anhäufung von AP-Stellen führt; und (d) geringere Effizienz der dRp-ase oder β-Eliminierung, was zu 5′-nicked AP-Stellen führt.
Endogene AP-Stellen in Ratten- und menschlichen Geweben. DNA wurde bei 4°C aus intaktem Rattengewebe und normaler menschlicher Leber extrahiert, und die Anzahl der AP-Stellen wurde mit dem ASB-Assay gemessen. A, typischer Röntgenfilm, der die endogenen AP-Stellen in Rattengewebe zeigt. Die DNA (einschließlich Standard-DNA-Proben) wurde auf eine NC-Membran geladen (1,5 μg pro Slot). B, densitometrische Scandaten endogener AP-Stellen in Ratten- und menschlichem Gewebe. Spalten, Mittelwerte aus doppelten Slots von fünf bis acht Einzelproben; Balken, SD.
Der wichtigste Prozess bei der Reparatur von AP-Stellen ist der Typ-II-AP-Endonuklease-/β-pol-abhängige Weg (7). Die Typ-II-AP-Endonuklease kann AP-Stellen erkennen und das Phosphodiester-Grundgerüst unmittelbar 5′ vor den Läsionen einschneiden, wobei eine 3′-Hydroxylgruppe und ein 5′-AP-Stellen-Terminus zurückbleiben (5). Das 5′-dRp wird anschließend freigesetzt, und die einzelne Nukleotidlücke wird aufgefüllt. Es wurde nachgewiesen, dass erhebliche Mengen an Typ-II-AP-Endonuklease im Zellkern von Säugetierzellen vorhanden sind (8). Zuvor hatten wir gezeigt, dass die Kombination von ASB-Assay und Typ-II-AP-Endonuklease oder NaOH eine 3′- bzw. 5′-Spaltung von AP-Stellen bewirkt (3). Um die Aktivität von AP-Endonuklease und dRp-ase in vivo zu verstehen, optimierten wir den Test zur Spaltung von AP-Stellen weiter. In diesem Experiment verwendeten wir Exo III als Typ-II-AP-Endonuklease zur Identifizierung der 3′-Spaltung von AP-Stellen und Putrescin zum Nachweis von 5′-Nicks (Abb. 2)⇓. Zur Charakterisierung dieses Tests zur Spaltung von AP-Stellen inkubierten wir DNA, die mit MX vorbehandelt worden war, um die Anzahl der AP-Stellen auf 3,8 ± 0,5 AP-Stellen pro 106 Nukleotide (Mittelwert ± SD) zu reduzieren, mit Hitze und Säurepuffer. Verschiedene Zeiträume der Hitze-/Säure-Inkubation induzierten 11, 47, 115 und 320 AP-Stellen pro 106 Nukleotide. Eine einmalige Behandlung mit Exo III reduzierte die Anzahl der AP-Stellen um 4-10 AP-Stellen pro 106 Nukleotide in jeder DNA-Probe, unabhängig von der ursprünglich vorhandenen Anzahl (Abb. 3)⇓. Diese Verringerung ist möglicherweise auf eine Kombination aus enzymatischem Einschnitt auf der 5′-Seite durch Exo III und unspezifischer 3′-Spaltung von AP-Stellen während der Inkubation mit Exo III zurückzuführen. Diese unspezifische 3′-Spaltung schloss eine genaue Quantifizierung der Anzahl der 3′-vernickelten AP-Stellen in der DNA mit diesem Assay aus. Im Gegensatz dazu zeigte die Behandlung mit Putrescin keine Verringerung der Anzahl der AP-Stellen. Nach Inkubation mit Exo III und anschließender Putrescin-Behandlung war die Anzahl der AP-Stellen in der mit MX vorbehandelten Kalbsthymus-DNA auf die ursprüngliche Anzahl der AP-Stellen reduziert. Die Effizienz der Spaltung von AP-Stellen durch die Kombination von Exo III und Putrescin betrug >99%.
Schema des Assays zur Spaltung von AP-Stellen. Um die Aktivitäten der Typ-II-AP-Endonuklease sowie der dRp-ase in vivo besser zu verstehen, bestimmten wir die Existenz von Spaltungen auf der 5′- oder 3′-Seite von AP-Stellen in genomischer DNA. Putrescin und Exo III (Typ II AP-Endonuklease) hinterlassen 3′-gespaltene bzw. 5′-gespaltene AP-Stellen. Bei intakten AP-Stellen ohne Schnitt an den 3′- und 5′-Seiten der AP-Stellen kann der ASB-Assay theoretisch die ursprüngliche Anzahl der AP-Stellen nach der Behandlung mit Exo III oder Putrescin nachweisen, da die AP-Stellen nach dem Schnitt auf beiden Seiten der an die AP-Stelle angrenzenden Phosphodiesterbindung auf dem DNA-Rückgrat verbleiben. Die Kombination von Exo III und Putrescin spaltet jedoch sowohl an der 3′- als auch an der 5′-Seite der AP-Stelle, was zu einer Freisetzung der AP-Stelle vom DNA-Rückgrat führt. Solche freigesetzten AP-Stellen werden mit diesem Assay nicht nachgewiesen. Anhand der Anzahl der AP-Stellen, die nach dieser Spaltungsreaktion auf dem DNA-Rückgrat verbleiben, kann die Anzahl der 5′- und 3′-gespaltenen AP-Stellen geschätzt werden. Wenn 5′-gespaltene AP-Stellen in der DNA vorhanden sind, kann die einmalige Behandlung mit Putrescin die 5′-geschnittenen AP-Stellen durch 3′-Spaltung der AP-Stellen freisetzen. Ebenso können 3′-geschnittene AP-Stellen in der DNA durch 5′-Schneiden mit Exo III freigesetzt werden.
AP-Stellen-Spaltversuch an mit Hitze-/Säurepuffer behandelter Kalbsthymus-DNA. Zur Validierung des AP-Stellen-Spaltungstests untersuchten wir die Auswirkungen von Exo III und Putrescin auf intakte AP-Stellen, die in Kalbsthymus-DNA induziert wurden. Die ursprüngliche Anzahl der AP-Stellen in der Kalbsthymus-DNA wurde durch MX (CTD/MX) reduziert. Anschließend wurde die DNA unterschiedlich lange in Hitze-/Säurepuffer inkubiert, um eine unterschiedliche Anzahl intakter AP-Stellen (-/-; Ref. 9) zu erzeugen. Die DNA wurde mit Exo III und/oder Putrescin inkubiert, und die Anzahl der verbleibenden AP-Stellen in der Kalbsthymus-DNA wurde mit dem ASB-Assay gemessen. Spalten, Mittelwerte aus doppelten Schlitzen von drei Einzelproben; Balken, SD. A, Assay zur Spaltung von AP-Stellen in DNA mit 115 AP-Stellen pro 106 Nukleotiden. B, Zusammenfassung des Assays zur Spaltung von AP-Stellen bei DNA mit einer unterschiedlichen Anzahl von AP-Stellen.
Wir haben diesen Assay auf genomische DNA angewandt, die aus Ratten- und menschlichem Gewebe extrahiert wurde, um endogene AP-Stellen zu charakterisieren. Die Fraktionen der intakten und gespaltenen AP-Stellen sowie der restlichen aldehydischen Läsionen sind in Abb. 4⇓ zusammengefasst. DNA aus Ratten- und menschlichem Gewebe wurde mit Exo III und anschließend mit Putrescin inkubiert, um zu untersuchen, ob es sich bei den entdeckten Läsionen um tatsächliche AP-Stellen handelt. Nach der 5′- und 3′-Spaltung von AP-Stellen wurden 1,5-2,2 restliche aldehydische Läsionen pro 106 Nukleotide nachgewiesen. Diese Daten deuten darauf hin, dass der ASB-Assay die endogenen AP-Stellen korrekt misst. Die verbleibenden Läsionen sind möglicherweise auf Einschränkungen der Enzymreaktionen beim AP-Stellen-Spaltungstest sowie auf das Vorhandensein endogener aldehydischer Basenläsionen wie Formyluracil zurückzuführen (10). Darüber hinaus wurde eine kombinierte Fraktion von 3′-gespaltenen und intakten AP-Stellen mit ∼2-3 Läsionen pro 106 Nukleotide in verschiedenen Geweben nachgewiesen, was ∼1/3-1/10 der Gesamtzahl der endogenen AP-Stellen entspricht. Um die Anzahl der 5′-gespaltenen AP-Stellen zu untersuchen, haben wir die DNA mit Putrescin inkubiert. Die Reduktion der AP-Stellen durch Putrescin (die ursprüngliche Anzahl der AP-Stellen abzüglich der Anzahl der nach der Putrescin-Inkubation verbleibenden AP-Stellen) stellt die Anzahl der 5′-gespaltenen AP-Stellen dar. Im Gegensatz zur mit Hitze-/Säurepuffer vorbehandelten Kälberthymus-DNA wies die mit Putrescin behandelte genomische DNA eine deutlich geringere Anzahl von AP-Stellen auf. Diese Daten deuten darauf hin, dass etwa zwei Drittel oder mehr der endogenen AP-Stellen bereits auf der 5′-Seite der AP-Stellen in vivo gespalten werden.
Zusammenfassung des AP-Stellen-Spaltungstests von Ratten- und menschlicher Gewebe-DNA. Die ursprüngliche Anzahl der AP-Stellen, wie in der Legende zu Abb. 1B⇓ beschrieben, bestand aus 5′-gespaltenen, 3′-gespaltenen, intakten AP-Stellen und restlichen aldehydischen Läsionen. Die Anzahl der 5′-gespaltenen AP-Stellen wurde berechnet als die ursprüngliche Anzahl der AP-Stellen abzüglich der Anzahl der nach der Behandlung mit Putrescin allein verbliebenen AP-Stellen. Der kombinierte Anteil von 3′-gespaltenen und intakten AP-Stellen war die Differenz zwischen der Behandlung mit Putrescin und der Kombinationsbehandlung mit Exo III und Putrescin. Die verbleibenden AP-Stellen zeigten die Anzahl der ungespaltenen aldehydischen Läsionen an.
Nach der 5′-Spaltung der AP-Stellen durch die Typ-II-AP-Endonuklease müssen die eingeschnittenen AP-Stellen anschließend durch die Exzision von 5′-dRp-Resten vom DNA-Rückgrat gelöst werden. Dieser Freisetzungsprozess wird möglicherweise von der dRp-Aase durch eine hydrolytische Reaktion (11) oder β-Eliminierung (12) oder durch ein endonukleolytisches Enzym durchgeführt, das stromabwärts von 5′-dRp-Einheiten schneidet (13). Es wurde nachgewiesen, dass Xenopus und menschliches β-pol 5′-dRp durch β-Eliminierung freisetzen (14). Unter Verwendung von Reparaturstellen in β-pol-null- oder -proficient-Zellen wurde gezeigt, dass ein einzelner Lückenreparaturweg in β-pol-proficient-Zellen vorherrschend war, nicht aber in β-pol-null-Zellen (15). Darüber hinaus beschleunigt die Interaktion zwischen menschlicher AP-Endonuklease und β-pol die Freisetzung von 5′-dRp-Resten in vitro (16). Die Reparatureffizienz von 5′-dRp-Resten ist jedoch weder in Zellen noch in vivo gut charakterisiert worden. Bei der Verwendung von zellfreien Hefeextrakten wurde festgestellt, dass die Verarbeitung der 5′-dRp-Reste ein ratenlimitierender Schritt bei der Basen-Exzisionsreparatur von Uracil-haltiger DNA ist (17). Außerdem wurde die katalytische Effizienz von β-pol zur Entfernung von 5′-dRp untersucht (18). Interessanterweise war die Kcat der 5′-dRp-Base-Aktivität von β-pol ∼100-mal niedriger als die Kcat der AP-Endonuklease. Diese Studie zeigt eine deutliche Persistenz von 5′-geschnittenen AP-Stellen in Ratten- und Menschengewebe. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Inzision durch die AP-Endonuklease und die anschließende Freisetzung von 5′-dRp-Resten in vivo möglicherweise nicht effizient miteinander verknüpft sind und dass der Reparaturprozess von 5′-dRp einer der geschwindigkeitsbegrenzenden Schritte bei der Basen-Exzisionsreparatur sein könnte.
In der vorangegangenen Studie (3) konnten wir nachweisen, dass unter physiologischen Bedingungen eine spontane Depurinierung von 1,5 AP-Stellen pro 106 Nukleotide pro Tag auftrat. Um zu prüfen, ob hitzelabile DNA-Addukte wie N3- und N7-Alkylpurine die Ursache für die höhere Zahl endogener AP-Stellen im Gehirn sind, wurde ein Depurinierungstest an DNA aus Gehirn und Leber durchgeführt. Es wurde jedoch kein Unterschied zwischen Gehirn und Leber festgestellt (Daten nicht gezeigt). Daher ist der stabile Zustand der endogenen AP-Stellen möglicherweise nicht auf labile Basenläsionen zurückzuführen. Eine der wichtigsten und häufigsten endogenen DNA-Läsionen ist die oxidative DNA-Basenschädigung. Es wurde berichtet, dass der stationäre Zustand von 5-Hydroxycytosin im Rattenhirn ∼2-mal höher ist als in der Rattenleber (19). Solche oxidativen Pyrimidinbasen werden durch End III repariert, wobei AP-Stellen auf dem DNA-Rückgrat verbleiben. Um zu untersuchen, ob oxidativer Stress mit der Anzahl der AP-Stellen in der DNA im Steady-State zusammenhängen könnte, wurden die End-III-empfindlichen Stellen mit einer Kombination aus dem ASB-Assay und E. coli End III quantifiziert. Die Zahl der End-III-empfindlichen Stellen war im Gehirn dreimal so hoch (14 Läsionen pro 106 Nukleotide) wie in anderen Geweben (4-5 Läsionen pro 106 Nukleotide). Kürzlich wurde das menschliche Homolog des End-III-Gens (hNTH1) kloniert und charakterisiert (20). Die mRNA-Expression dieses Gens variiert zwischen den Organen nach einem Muster, das der Anzahl der endogenen AP-Stellen entspricht (20). Die meisten DNA-Glykosylasen, die an der Reparatur oxidierter Basen beteiligt sind, besitzen eine AP-Lyase-Aktivität, die die 3′-Seite von AP-Stellen spaltet. Daher würden endogene 5′-AP-Stellen nicht aus den Spaltungen oxidativer Basen durch solche DNA-Glykosylasen stammen. Ein vorläufiges Experiment zeigte, dass Wasserstoffperoxid mit FeSO4 direkt 5′-gespaltene AP-Stellen in der Kalbsthymus-DNA induziert, ohne dass Enzyme beteiligt sind (Daten nicht gezeigt). Diese Studien deuten darauf hin, dass oxidativer Stress einer der Faktoren sein könnte, die für den stabilen Zustand von AP-Stellen mit 5′-Spaltung verantwortlich sind.
Ursprünglich hatten wir erwartet, dass wir aufgrund ihrer Toxizität und Mutagenität nur eine geringe Anzahl endogener AP-Stellen in genomischer DNA finden würden. Diese Studie zeigt jedoch, dass der Dauerzustand der AP-Stellen ∼1 Läsion pro 105 Nukleotide in der genomischen DNA ist. Obwohl AP-Stellen ständig repariert werden, trägt der Anteil der AP-Stellen, der der Reparatur entgeht, wahrscheinlich zu Mutationen, Chromosomenaberrationen und Transkriptionsfehlern bei, die mit spontanen altersbedingten Krankheiten wie Krebs und degenerativen Störungen in Verbindung gebracht werden können.