Výsledky a diskuse
Pro lepší pochopení vzniku a opravy AP míst vznikajících v důsledku opravy excizí bází a spontánní depurinace/depyrimidinace in vivo, jsme měřili počet endogenních AP míst v genomové DNA extrahované z různých tkání dospělých potkanů a lidských jater v transplantační kvalitě pomocí testu ASB (3). Počet endogenních míst AP se značně lišil mezi jednotlivými tkáněmi (obr. 1)⇓ , ale ne v rámci tkání. Nejvyšší počet míst AP byl zjištěn v mozku s 30 místy AP na 106 nukleotidů, následovalo srdce a tlusté střevo. Naproti tomu játra, ledviny a plíce potkanů vykazovaly trvale nejnižší počet míst AP (8-9 míst AP na 106 nukleotidů). Počet endogenních AP míst v lidských játrech byl srovnatelný s počtem míst v játrech potkanů. Tyto údaje naznačují, že za normálních fyziologických podmínek přetrvává 50 000-200 000 AP míst na savčí buňku. Ustálený počet míst AP v genomové DNA by měl odrážet rovnováhu mezi tvorbou a opravou míst AP. Možné interpretace vyššího počtu endogenních AP míst v mozku jsou následující: (a) vyšší míra depurinace a/nebo tvorby endogenních aduktů DNA, což vede k většímu počtu míst AP; (b) vyšší aktivita DNA glykosylázy, která vyvolává větší počet míst AP; (c) nižší aktivita AP endonukleázy typu II, která způsobuje akumulaci míst AP; a (d) nižší účinnost dRp-ázy nebo β-eliminace, což ponechává 5′-niklová místa AP.
Endogenní AP místa v potkaních a lidských tkáních. DNA byla extrahována při 4 °C z intaktních tkání potkanů a normálních lidských jater a počet míst AP byl měřen pomocí testu ASB. A, typický rentgenový snímek zobrazující endogenní AP místa potkaních tkání. DNA (včetně standardních vzorků DNA) byla naložena na NC membránu (1,5 μg na slot). B, skenovací denzitometrické údaje endogenních míst AP v potkaních a lidských tkáních. Sloupce, průměry z duplicitních slotů pěti až osmi jednotlivých vzorků; sloupce, SD.
Hlavním procesem při opravě AP míst je cesta závislá na endonukleáze typu II/β-pol (7). AP endonukleáza typu II dokáže rozpoznat AP místa a naříznout fosfodiesterovou páteř bezprostředně 5′ od lézí, přičemž zůstane 3′-hydroxylová skupina a 5′-konec AP místa (5). Následně se uvolní 5′-dRp a vyplní se jednonukleotidová mezera. Bylo prokázáno, že v jádře savčích buněk je přítomno značné množství AP endonukleázy typu II (8). Dříve jsme ukázali, že kombinace testu ASB a AP endonukleázy typu II nebo NaOH vyvolává štěpení 3′, resp. 5′ míst AP (3). Abychom pochopili aktivitu AP endonukleázy a dRp-ázy in vivo, dále jsme optimalizovali test štěpení AP míst. V tomto experimentu jsme použili Exo III jako endonukleázu typu II AP k identifikaci 3′-štěpení míst AP a putrescin k detekci 5′-štěpení (obr. 2)⇓. Abychom charakterizovali tento test štěpení míst AP, inkubovali jsme DNA, která byla předem ošetřena MX, aby se snížil počet míst AP na 3,8 ± 0,5 míst AP na 106 nukleotidů (průměr ± SD), s tepelným a kyselým pufrem. Různé doby tepelné/kyselé inkubace vyvolaly 11, 47, 115 a 320 AP míst na 106 nukleotidů. Jednorázové ošetření přípravkem Exo III snížilo počet míst AP o 4-10 míst AP na 106 nukleotidů v každém vzorku DNA bez ohledu na počáteční počet přítomných míst (obr. 3)⇓. Toto snížení může být způsobeno kombinací enzymatického naříznutí na 5′ straně Exo III a nespecifického 3′ štěpení AP míst během inkubace s Exo III. Toto nespecifické 3′ štěpení znemožnilo přesné kvantifikování počtu 3′-niklovaných míst AP v DNA pomocí tohoto testu. Naproti tomu ošetření putrescinem neprokázalo žádné snížení počtu AP míst. Po inkubaci s Exo III a následné inkubaci s putrescinem se počet AP míst snížil na původní počet AP míst v DNA telecího brzlíku před ošetřením MX. Účinnost štěpení míst AP kombinací Exo III a putrescinu byla >99 %.
Schéma testu štěpení míst AP. Abychom lépe pochopili aktivity endonukleázy typu II AP, stejně jako dRp-ázy in vivo, stanovili jsme existenci štěpení na 5′ nebo 3′ straně míst AP v genomové DNA. Putrescin a Exo III (AP endonukleáza typu II) zanechávají 3′- a 5′-štěpená místa AP. U neporušených míst AP bez naříznutí na 3′ a 5′ straně míst AP může test ASB teoreticky zjistit původní počet míst AP po ošetření Exo III nebo putrescinem, protože místa AP zůstávají na páteři DNA po naříznutí na obou stranách fosfodiesterové vazby sousedící s místem AP. Kombinace Exo III a putrescinu však štěpí jak na 3′, tak na 5′ straně AP místa, což vede k uvolnění AP místa z páteře DNA. Takto uvolněná místa AP nejsou tímto testem detekována. Na základě počtu míst AP, která zůstala na páteři DNA po této štěpné reakci, lze odhadnout počet míst AP odštěpených z 5′ a 3′. Pokud jsou v DNA přítomna 5′-štěpená místa AP, může jednorázové ošetření putrescinem uvolnit 5′-štěpená místa AP pomocí 3′-štěpení míst AP . Podobně lze 3′-niklovaná místa AP v DNA uvolnit 5′-excizí pomocí Exo III .
Test štěpení míst AP v DNA telecího brzlíku ošetřené tepelným/kyselým pufrem. Pro ověření testu štěpení míst AP jsme zkoumali účinky Exo III a putrescinu na neporušená místa AP indukovaná v DNA telecího thymu. Původní počet míst AP v DNA telecího brzlíku byl snížen pomocí MX (CTD/MX). DNA byla poté inkubována v tepelném/kyselém pufru po různě dlouhou dobu, aby se zavedl různý počet intaktních AP míst (-/-; Ref. 9). DNA byla inkubována s Exo III a/nebo putrescinem a počet zbývajících AP míst v DNA telecího thymu byl měřen pomocí testu ASB . Sloupce, průměry z duplikátů tří jednotlivých vzorků; sloupce, SD. A, test štěpení míst AP u DNA obsahující 115 míst AP na 106 nukleotidů. B, shrnutí testu štěpení míst AP u DNA obsahující různé počty míst AP.
Tento test jsme použili na genomovou DNA získanou z potkaních a lidských tkání, abychom charakterizovali endogenní místa AP. Frakce intaktních a rozštěpených míst AP a zbytkové aldehydické léze jsou shrnuty na obr. 4⇓. DNA krysích a lidských tkání byla inkubována s Exo III a následně s putrescinem, aby se zjistilo, zda zjištěné léze jsou skutečná AP místa. Po 5′ a 3′ štěpení míst AP bylo zjištěno 1,5-2,2 zbytkových aldehydických lézí na 106 nukleotidů. Tyto údaje naznačují, že test ASB správně měří endogenní místa AP. Zbytkové léze mohou být způsobeny omezeními enzymových reakcí při testu štěpení míst AP a také přítomností endogenních aldehydických lézí bází, jako je formyluracil (10). Kromě toho byla v různých tkáních zjištěna kombinovaná frakce 3′-štěpených a intaktních míst AP s ∼2-3 lézemi na 106 nukleotidů, což je ∼1/3-1/10 celkového počtu endogenních míst AP. Abychom prozkoumali počet 5′-cleaved AP míst, inkubovali jsme DNA s putrescinem. Snížení počtu míst AP putrescinem (původní počet míst AP minus počet míst AP, která zůstala po inkubaci s putrescinem) představuje počet 5′-cleaved míst AP. Na rozdíl od DNA telecího brzlíku předem ošetřené tepelným/kyselým pufrem měla genomová DNA ošetřená putrescinem výrazně snížený počet AP míst. Tyto údaje naznačují, že přibližně dvě třetiny nebo více endogenních míst AP jsou již in vivo štěpeny na 5′ straně míst AP
Souhrn testu štěpení míst AP na DNA potkana a lidské tkáně. Původní počet míst AP popsaný v legendě k obr. 1B⇓ se skládal z 5′-štěpených, 3′-štěpených, intaktních míst AP a zbytkových aldehydických lézí. Počet 5′-cleaved AP míst byl vypočítán jako původní počet AP míst minus počet AP míst, která zůstala po léčbě samotným putrescinem. Kombinovaný podíl 3′-cleaved a intaktních AP míst byl rozdílem mezi léčbou putrescinem a kombinovanou léčbou Exo III a putrescinem. Zbylá místa AP vykazovala počet neštěpených aldehydických lézí.
Po 5′ štěpení míst AP endonukleázou typu II musí být naříznutá místa AP následně uvolněna z páteře DNA prostřednictvím excize 5′-dRp zbytků. Tento proces uvolnění je pravděpodobně prováděn dRp-ázou prostřednictvím hydrolytické reakce (11) nebo β-eliminací (12) nebo prostřednictvím endonukleolytického enzymu, který nařezává řetězce 5′-dRp (13). Bylo prokázáno, že Xenopus a lidský β-pol uvolňují 5′-dRp β-eliminací (14). Pomocí velikosti opravných záplat buď v β-pol-nulových, nebo -proficientních buňkách bylo prokázáno, že v β-pol-proficientních buňkách převažuje jediná cesta opravy mezery, ale ne v β-pol-nulových buňkách (15). Kromě toho interakce mezi lidskou AP endonukleázou a β-polem urychluje uvolňování 5′-dRp zbytků in vitro (16). Účinnost opravy 5′-dRp částí však nebyla dobře charakterizována v buňkách ani in vivo. Pomocí bezbuněčných extraktů kvasinek bylo zjištěno, že zpracování 5′-dRp částí je rychlost limitujícím krokem během opravy excize bází DNA obsahující uracil (17). Dále byla zkoumána katalytická účinnost β-polu při odstraňování 5′-dRp (18). Je zajímavé, že Kcat 5′- dRp-ázové aktivity β-polu byla ∼100krát nižší než Kcat AP endonukleázy. Tato studie prokazuje jasnou perzistenci 5′-inkludovaných míst AP v potkaních a lidských tkáních. Tyto údaje naznačují, že incize AP endonukleázou a následné uvolnění 5′-dRp zbytků nemusí být na základní úrovni in vivo efektivně propojeny a že proces opravy 5′-dRp může být jedním z rychlost limitujících kroků při opravě excize bází.
V předchozí studii (3) jsme prokázali, že za fyziologických podmínek dochází ke spontánní depurinaci 1,5 AP míst na 106 nukleotidů za den. Abychom otestovali, zda jsou zdrojem vyššího počtu endogenních AP míst v mozku tepelně labilní adukty DNA, jako jsou N3- a N7-alkylpuriny, byl proveden test depurinace v mozkové a jaterní DNA. V mozku a játrech však nebyl pozorován žádný rozdíl (údaje nejsou uvedeny). Ustálený stav endogenních AP míst tedy nemusí být způsoben labilními bazickými lézemi. Jednou z nejdůležitějších a nejhojnějších endogenních lézí DNA je oxidační poškození bází DNA. Bylo zjištěno, že ustálený stav 5-hydroxycytosinu v mozku potkanů je ∼2krát vyšší než v játrech potkanů (19). Takovéto oxidativní poškození pyrimidinových bází opravuje End III, přičemž na páteři DNA zůstávají místa AP. Abychom zjistili, zda oxidační stres může souviset s počtem míst AP v DNA v ustáleném stavu, byla místa citlivá na End III kvantifikována pomocí kombinace testu ASB a E. coli End III. Počet míst citlivých na End III byl třikrát vyšší v mozku (14 lézí na 106 nukleotidů) ve srovnání s ostatními tkáněmi (4-5 lézí na 106 nukleotidů). Nedávno byl klonován a charakterizován lidský homolog genu End III (hNTH1) (20). Exprese mRNA tohoto genu se v jednotlivých orgánech liší podle vzorce, který odpovídá počtu endogenních míst AP (20). Většina DNA glykosylas, které se podílejí na opravě oxidovaných bází, má aktivitu AP lyasy, která štěpí 3′ stranu AP míst. Proto by endogenní 5′ AP místa neměla pocházet ze štěpení oxidovaných bází těmito DNA glykosylasami. Předběžný pokus ukázal, že peroxid vodíku s FeSO4 přímo indukoval 5′-štěpená AP místa v DNA telecího brzlíku bez jakýchkoli enzymů (údaje nejsou uvedeny). Tyto studie naznačují, že oxidační stres by mohl být jedním z faktorů odpovědných za ustálený stav míst AP s 5′ štěpením.
Původně jsme očekávali, že v genomové DNA najdeme nízký počet endogenních míst AP kvůli jejich toxicitě a mutagenitě. Tato studie však ukazuje, že ustálený stav míst AP je ∼1 léze na 105 nukleotidů v genomové DNA. Ačkoli jsou místa AP neustále opravována, část míst AP, která uniká opravě, pravděpodobně přispívá k mutacím, chromozomovým aberacím a chybám transkripce, které mohou být spojeny se spontánními onemocněními souvisejícími s věkem, jako je rakovina a degenerativní poruchy.
.