Het actieve site residu, His(15), in histidine-bevattend eiwit, HPr, kan worden vervangen door aspartaat en nog steeds fungeren als fosfoacceptor en fosfodonor met respectievelijk enzym I en enzym IIA(glucose). Andere substituties, waaronder cysteïne, glutamaat, serine, threonine en tyrosine, vertoonden geen enkele activiteit. Enzym I K(m) voor His(15) –> Asp HPr is 10-voudig verhoogd en V(max) is 1000-voudig verlaagd vergeleken met wild type HPr. De fosforylering van Asp(15) leidde tot een spontane interne herschikking met verlies van de fosforylgroep en een watermolecuul, wat bevestigd werd door massaspectrometrie. De gevormde eiwitsoort had een hogere pI dan His(15) –> Asp HPr, wat zou kunnen ontstaan door de vorming van een succinimide of een isoimide. Hydrolyse van de geïsoleerde hoge pI vorm gaf alleen asparaginezuur bij residu 15, en er werd geen isoasparaginezuur gedetecteerd. Dit wijst erop dat eerder een isoimide dan een succinimide wordt gevormd. In afwezigheid van fosforylering kon geen vorming van de hoge pI vorm worden gevonden, wat erop wijst dat fosforylering de vorming van de cyclisatie katalyseerde. De mogelijke betrokkenheid van Asn(12) in een interne cyclisatie met Asp(15) werd geëlimineerd door de Asn(12) –> Ala mutatie in His(15) –> AspHPr. Asn(12) substituties van alanine, aspartaat, serine, en threonine in wild type HPr wezen op een algemene vereiste voor residuen die in staat zijn een waterstofbrug te vormen met het Nepsilon(2) atoom van His(15), maar eliminatie van de waterstofbrug heeft slechts een 4-voudige daling in k(cat)/K(m) tot gevolg.
Organisatorische affiliatie: 
Department of Biochemistry, University of Saskatchewan, Saskatchewan S7N 5E5, Canada.
Hide Full Abstract