El residuo del sitio activo, His(15), en la proteína que contiene histidina, HPr, puede ser sustituido por aspartato y seguir actuando como fosfoaceptor y fosfodonor con la enzima I y la enzima IIA(glucosa), respectivamente. Otras sustituciones, como la cisteína, el glutamato, la serina, la treonina y la tirosina, no mostraron ninguna actividad. La K(m) de la enzima I para His(15) –> Asp HPr se multiplica por 10 y la V(max) se reduce por 1000 en comparación con la HPr de tipo salvaje. La fosforilación de Asp(15) condujo a un reordenamiento interno espontáneo que implicaba la pérdida del grupo fosforilo y de una molécula de agua, lo que se confirmó por espectrometría de masas. La especie proteica formada tenía un pI más alto que el de His(15) –> Asp HPr, lo que podría deberse a la formación de una succinimida o una isoimida. La hidrólisis de la forma aislada de alto pI sólo dio ácido aspártico en el residuo 15, y no se detectó ácido isoaspártico. Esto indica que se forma una isoimida y no una succinimida. En ausencia de fosforilación, no se pudo encontrar la formación de la forma de alto pI, lo que indica que la fosforilación catalizó la formación de la ciclación. La posible participación del Asn(12) en una ciclización interna con Asp(15) se eliminó mediante la mutación Asn(12) –> Ala en His(15) –> AspHPr. Las sustituciones Asn(12) de alanina, aspartato, serina y treonina en HPr de tipo salvaje indicaron un requisito general de residuos capaces de formar un enlace de hidrógeno con el átomo Nepsilon(2) de His(15), pero la eliminación del enlace de hidrógeno sólo tiene una disminución de 4 veces en k(cat)/K(m).
Afiliación organizativa: 
Departamento de Bioquímica, Universidad de Saskatchewan, Saskatchewan S7N 5E5, Canadá.
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