Os pesquisadores podem escolher entre vários sistemas LSFM/SPIM (Single/Selective Plane Illumination Microscopy) que diferem em certos aspectos, mas todos têm as seguintes características principais: ao contrário da microscopia fluorescente confocal ou de grande rendimento, apenas uma fina secção da amostra é iluminada por uma folha de luz. Outra diferença importante é a separação das vias ópticas de iluminação e detecção. Para evitar a medição da fluorescência desfocada, a luz emitida é detectada num eixo diferente da iluminação (por exemplo, ortogonal). Ao fazer isto, a fluorescência desnecessária fora de foco não é excitada, o que impede a fotodepilação e a fotodepilação em regiões que não estão sendo escaneadas. Finalmente, com o LSFM, a imagem é criada pela digitalização de um plano de luz (secção óptica), em vez de ponto a ponto, o que aumenta significativamente a velocidade de digitalização quando comparado com a microscopia confocal.
Estas vantagens – stress celular reduzido, fluorescência de fundo e consumo de tempo – são especialmente importantes quando se faz imagens 3D de células vivas de amostras biológicas sensíveis.