Los investigadores pueden elegir entre varios sistemas LSFM/SPIM (Microscopía de iluminación de plano único/selectivo) que difieren en ciertos aspectos, pero todos tienen las siguientes características principales: a diferencia de la microscopía de fluorescencia confocal o de campo amplio, sólo una sección delgada de la muestra es iluminada por una lámina de luz. Otra diferencia importante es la separación de las vías ópticas de iluminación y detección. Para evitar la medición de la fluorescencia desenfocada, la luz emitida se detecta en un eje diferente al de la iluminación (por ejemplo, ortogonal). De este modo, no se excita la fluorescencia desenfocada innecesaria, lo que evita el fotoblanqueo y el fotodaño en las regiones que no se están explorando en ese momento. Por último, con el LSFM, la imagen se crea mediante el escaneo de un plano de luz (seccionamiento óptico), en lugar de punto por punto, lo que aumenta notablemente la velocidad de escaneo en comparación con la microscopía confocal.
Estas ventajas -reducción del estrés celular, de la fluorescencia de fondo y del consumo de tiempo- son especialmente importantes cuando se realizan imágenes de células vivas en 3D de muestras biológicas sensibles.