2,4-Dinitrofenilhidrazon-származékok szintézise és antimikrobiális rezisztenciamoduláló hatása egyes ESKAPE humán patogénekkel szemben

Abstract

Hat új fenilhidrazon könyvtárát szintetizáltuk és értékeltük in vitro antimikrobiális és rezisztenciamoduláló hatásukat Gram-pozitív, Gram-negatív és gombafajok egy csoportjával szemben. A vegyületeket jó, 60-92 tömegszázalékos hozammal állították elő, és olvadáspont, UV-látható spektroszkópia, infravörös és nukleáris mágneses rezonancia (1H, 13C és DEPT-Q) technikákkal jellemezték. Tömegspektroszkópiával igazoltuk az egyik legaktívabb vegyület, az 5 azonosságát. A fenilhidrazonok mind a hat kiválasztott mikroorganizmussal szemben aktivitást mutattak, a legaktívabb vegyületek, az 1 és az 5 minimális gátló koncentrációja (MIC) 138 µM (Klebsiella pneumoniae), illetve 165 µM (Streptococcus pneumoniae) volt. Az 1. vegyület továbbá magas, 1,078 µM-os rezisztenciamoduláló aktivitást mutatott a Streptococcus pneumoniae és a Klebsiella pneumoniae ellen.

1. Bevezetés

A világ az utóbbi évtizedekben kifogyóban van a hatékony antibiotikumokból a multidrog-rezisztens organizmusok növekvő előfordulása miatt . Ez a rezisztens fertőzések növekedéséhez vezetett, ami megköveteli a tudósoktól, hogy könyörtelenül feltárják az aktív vagy vezető vegyületek analógjainak szintézisének lehetőségét új antimikrobás szerekként, hogy megfékezzék ezeket a fertőzéseket és az ebből eredő betegségeket. A fertőző betegségek az évszázadok során az emberiség létezésére nézve komoly fenyegetést jelentettek, mivel továbbra is jelentős negatív hatást gyakorolnak a társadalomra. A kórokozók, mint például a baktériumok, vírusok, gombák és paraziták továbbra is megjelennek, és különösen a 21. században a visszaszorításukra tett számos kísérlet ellenére egyre inkább terjednek. A fertőző betegségek évente mintegy 17 millió ember haláláért felelősek, és legalább harminc új betegség jelenik meg. A világ jelenleg a koronavírus által okozott COVID-19 világjárvány ellen küzd, amely három hónap alatt már több mint 25 000 emberéletet követelt világszerte (WHO, 2020). Ezek a betegségek emberek millióinak egészségét fenyegetik, különösen azért, mert nem létezik gyógymód vagy vakcina. A mikrobiális fertőzések növekvő tendenciája nagyrészt az antimikrobiális rezisztencia örökös problémájának köszönhető, amely egyre nagyobb teret hódít. Az antimikrobiális rezisztencia legfontosabb okai közé tartozik a hosszan tartó kemoterápia és az adagolási rend be nem tartása .

Az antibiotikumokkal szembeni növekvő rezisztencia az olyan kórokozók növekvő trendjéhez vezetett, mint a meticillinrezisztens Staphylococcus aureus (MRSA), a multirezisztens Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) és a multirezisztens Escherichia coli (MDR-Escherichia coli) . Ezenkívül a nosocomiális fertőzések kezelésében a legnagyobb gondot az ESKAPE kórokozók (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa és Enterobacter fajok) jelentik . Jelenlétük a fertőzésekben aggodalomra ad okot az egészségügyben, mivel legtöbbjük számos antibiotikummal szemben rezisztens, és e törzsek rezisztencia mechanizmusának megértése hasznos az új antimikrobiális szerek kifejlesztésében .

Az Egészségügyi Világszervezet világossá tette, hogy a fertőző betegségek növekvő tendenciája számos tényező miatt folytatódna, beleértve a vidék-város migrációt, a globális népesség növekedését, a mikrobiális alkalmazkodást és az éghajlatváltozást . Ezek kedveznének a kórokozók megjelenésének és terjedésének, ezért az érdekeltek, beleértve a gyógyszerkémikusokat is, folyamatosan arra ösztönzik, hogy stratégiákat dolgozzanak ki új kemoterápiás szerek felfedezésére az antimikrobiális rezisztencia fenyegetésének leküzdése érdekében . Egy vegyület rezisztenciamoduláló aktivitása a vegyület azon képessége, hogy a már ismert szabványokra különösen pozitív irányító hatást gyakoroljon. A mikroorganizmusok antibiotikumokkal szembeni növekvő rezisztenciája miatt úgy tűnik, hogy a természetes vagy szintetikus forrásokból származó szerek modulálják néhány standard antimikrobiális szer, például az amoxicillin (a), a ciprofloxacin (b) és a flukonazol (c) aktivitását (1. ábra).

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

1. ábra

Néhány standard antibiotikum kémiai szerkezete : (a) amoxicillin; (b) ciprofloxacin; (c) flukonazol.

A standard antibiotikumokra ható (természetes és szintetikus) termékek rezisztenciamoduláló hatása az utóbbi években tudományos érdeklődésre tett szert. Ennek célja az antimikrobiális hatékonyság maximalizálása, amely jelentős előrelépést jelent a mikrobiális rezisztencia megfékezésében, és ezáltal potenciális gyógyszerkutatáshoz vezet. Az ilyen szintetikus szerek egyik fontos osztálya, amely ígéretes rezisztencia-moduláló hatással rendelkezik, a hidrazonok . A hidrazonok és analógjaik azometin funkcionalitással rendelkeznek, ami a biológiai aktivitások széles spektrumával rendelkező vegyületek fontos csoportja. A hidrazonokat a farmakológiai tevékenységek széles skálája, például görcsoldó, gyulladáscsökkentő, antimikrobiális, antiprotozoás és rákellenes hatásuk miatt választották. Nemcsak a biológiában, hanem a fotokémia, az analitikai kémia és a szervetlen kémia területén is döntő szerepet játszanak. A hidrazonok a ketonokkal és az aldehidekkel az oxigén -NNH2 funkciós résszel történő helyettesítésével rokonok. A különböző szintetikus protokollok és a részletes szerkezet-aktivitás kapcsolat (SAR) vizsgálatoknak köszönhetően különböző hidrazon származékokat fejlesztettek ki és fedeztek fel, amelyek farmakológiailag aktívak különböző célpontokon . Egyes izonikotinoil hidrazon-származékokról megállapították, hogy antituberkuláris aktivitással rendelkeznek. Továbbá a benzoesav-hidrazon származék 4-hidroxi-benzoesav-hidrazid (nifuroxazid) bélférgek ellen aktívnak bizonyult, és a 4-fluorbenzoesav-hidrazid származék 3,13 μg/ml antibakteriális aktivitást mutatott Staphylococcus aureus ATCC 29213 ellen és a fogékony Mycobacterium tuberculosis H37RV törzs ellen szintén 3,13 μg/ml-nél . A közelmúltban szintetizált hidrazonok, köztük a nifuroxazid, aktívnak bizonyultak a Mycobacterium tuberculosis H37RV törzzsel szemben 0,78-6,25 μg/ml minimális gátló koncentrációtartományban. Egy új szer, a 3,5-dibenzoilvanillin-hidrazon és az átmeneti fémkomplexek lenyűgöző antibakteriális aktivitást mutattak.

Ezzel a tanulmányban hat új fenilhidrazon-származékot sikerült nukleofil kondenzációs reakcióval szintetizálni, antimikrobiális aktivitásukat és rezisztenciamoduláló hatásukat vizsgálták.

2. Anyagok és módszerek

2.1. A vizsgálatok eredményei. Szintézis: Általános anyagok és módszerek

Egy mágneses keverőpálcával felszerelt kerekfenekű lombikba (100 mL) jégfürdőben tartott metanolban (10 mL) lévő 2,4-dinitrofenilhidrazin (1 ekv.) került. Az így kapott szuszpenziót kevertettük és 0°C-ra hűtöttük, majd cseppenként tömény H2SO4 (98% v/v, 2 mL) hozzáadása után halványsárga oldatot kaptunk. Szobahőmérsékletre hűtés után hozzáadtunk egy aldehid- vagy ketonszármazékot (1,04 ekv.) metanolban (5 mL), és az elegyet addig kevertettük, amíg fokozatosan csapadék képződött, amelyet 24 órán keresztül hagytunk. A kémiai reakciók előrehaladását vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) követtük nyomon szakaszosan, szilikagéllel (60 GF254) bevont alumíniumlemezek segítségével. A lemezeket 254 nm-en és 366 nm-en UV-fényben vizualizáltuk, amit anizaldehiddel történő permetezés követett a foltok azonosságának megerősítése céljából. A nyers terméket szívószűréssel szűrtük és forró abszolút etanolból (96% v/v) átkristályosítottuk. A szilárd terméket szívószűréssel nyertük, megszárítottuk és szobahőmérsékleten tároltuk.

A szintetizált vegyületek szerkezetét olvadáspont-meghatározással, tömegspektroszkópiával, 1D NMR (proton és szén-13) és 2D NMR (DEPT-Q) spektroszkópiával állapítottuk meg, infravörös (IR) és ultraibolya-látható (UV-Vis) spektroszkópiai technikák támogatásával.

2.1.1. A szintetizált vegyületek szerkezetének megállapítása. 1-(2,4-Dinitrofenil)-2-(difenilmetilén)hidrazin

2, 4-Dinitrofenilhidrazin (0,50 g, 2,74 mmol, 1 ekv.) benzofenon (0,53 g, 1,04 ekv., 2,64 mmol) jelenlétében a nyers terméket kaptuk, amelyet forró etanolból történő átkristályosítással tisztítottunk, hogy a terméket (0,84 g, 85%) világos narancsszínű szilárd anyagként kapjuk. (Pet. éter 70%: EtOAc 30%): 0,90. Mpt: 141-143°C; UV-V (MeOH) : 382 nm. Infravörös (tiszta) υmax cm-1: 3382 (OH), 3286 (NH), 1586 (C = CH), 848, 614 (ArH). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 11,24 (1H, H-C1, s, NH), 9,09-9,10 (1H, H-C3, s, ArH), 8,41 (1H, H-C5, d, J = 2,4, ArH), 8,37-8,38 (1H, H-C6, m, ArH), 7.66-7,72 (5H, H-C4′, H-C5′, H-C6′, H-C5′, H-C3′, m, ArH), 7,35 (3H, H-C6″, H-C5″, H-C4″, m, ArH), 7,57 (2H, H-C5′, H-C3′, m, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz; CDCl3) 155,7, 145,1, 136,5, 131,9, 130,5, 130,4, 130,1, 129,9, 128,6, 128,2, 127,9, 123,4, 116,6 ppm.

2.1.2. 1-Benzilidén-2-(2,4-dinitrofenil)hidrazin

2, 4-Dinitrofenilhidrazin (0,90 g, 4,53 mmol, 1 ekv.) benzaldehid (0,50 g, 1,04 ekv., 4,71 mmol) jelenlétében a nyers terméket kaptuk, amelyet forró etanolból történő átkristályosítással tisztítva a terméket (1,01 g, 78%) sárga szilárd anyagként kaptuk. (Pet. éter 70%: EtOAc 30%): 0,83. Mpt: 178-180°C; UV-V (MeOH) : 224 nm és 378 nm. Infravörös (tiszta) υmax cm-1: 3337 (OH), 3283 (NH), 3100 (C = CH), 1618, 1584 (ArC = C). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,24 (1H, H-C1, s, NH), 9,09 (1H, H-C3, s, ArH), 8,30-8,31 (1H, H-C1′, s, N = CH), 8,05 (1H, H-C5, m, ArH), 8.02 (1H, H-C6, m, ArH), 7,41-7,69 (2H, H-C2′, H-C6′, m, ArH), 7,40 (1H, H-C4′, m, ArH), 7,39 (2H, H-C3′, H-C5′, m, ArH). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 147,9, 145,8, 144,9, 144,7, 131,0, 130,0, 129,0, 127,6, 123,5, 116,8 ppm.

2.1.3. 3-(2-2-(4-Dinitrofenil) hidrazono) metilfenol

2, 4-Dinitrofenilhidrazin (0,78 g, 3,93 mmol, 1 ekv.) m-hidroxibenzaldehid (0,50 g, 1,04 ekv., 4,09 mmol) adta a nyers terméket, amelyet forró etanolból történő átkristályosítással tisztítottunk, hogy a terméket (0,76 g, 64%) sötétvörös szilárd anyagként kapjuk. (Pet. éter 70%: EtOAc 30%): 0,74. Mpt: 277-280°C. UV-Vis (MeOH) : 392 nm. Infravörös (tiszta) υmax cm-1: 3420 (OH), 3257 (NH), 3116 (C = CH), 1607, 1584 (ArC = C). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,56 (1H, H-C1, s, NH), 10,04 (1H, H-C2′, s, ArOH), 8,88 (1H, H-C3, s, ArH), 8,86 (1H, H-C7, s, N = CH), 8,35-8,37 (1H H-C5, d, J = 8.0, ArH), 8,08-8,34 (1H, H-C6), d, J = 12,0, ArH), 8,05 (1H, H-C5′, m, ArH), 7,66 (1H, H-C1′, s, ArH), 7,14 (1H, H-C4′, m, ArH), 6,87-6,89 (1H (H-C3′, m, ArH). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 160,5, 150,5, 144,9, 137,1, 130,2, 129,8, 129,5, 125,2, 123,6, 117,1, 116,4 ppm.

2.1.4. 4-(2-(2-(2,4-Dinitrofenil) hidrazono) metil)-2-metoxifenol

2, 4-Dinitrofenilhidrazin (0,78 g, 3,93 mmol, 1 ekv.) 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehid (vanillin) (0,50 g, 1,04 ekv.) jelenlétében, 4,09 mmol) adta a nyers terméket, amelyet forró etanolból történő átkristályosítással tisztítottunk, hogy a terméket (0,91 g, 70%) élénkvörös szilárd anyagként kapjuk. (Pet. éter 70%: EtOAc 30%): 0,66. Mpt: 270-273°C. UV-Vis (MeOH) : 218 nm és 394 nm. Infravörös (tiszta) υmax cm-1: 3363 (OH), 3274 (NH), 3111 (C = CH), 1605 (ArC = C), 699 (ArH). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,58 (1H, s, NH), 10,11 (1H, H-C4′, s, ArOH), 9,94 (1H, H-C3, s, ArH), 8,87 (1H, H-C5, s, ArH), 8,86 (1H, H-C7, s, N = CH), 8,35 (1H, H-C6, d, J = 4.0, ArH), 7,97 (1H, H-C2′, d, J = 4,0, ArH), 7,66-7,76 (1H, H-C6′, d, J = 8,0, ArH), 6,38-6,35 (1H, H-C5′, d, J = 12,0, ArH), (3H, H-C4′, Ar-OCH3). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 150,7, 150,2, 148,6, 144,9, 137,1, 130,2, 125,6, 123,6, 123,1, 117,2, 116,1, 110,3, 56,2 ppm.

2.1.5. (Z)-2-(2, 4-Dinitrofenil) hidrazono) metil-fenol

2, 4-Dinitrofenilhidrazin (0,78 g, 3,93 mmol, 1 ekv.) szalicilaldehid (0,50 g, 4,09 mmol, 1,04 ekv.) jelenlétében a nyers terméket kaptuk, amelyet forró etanolból történő átkristályosítással tisztítottunk, hogy a terméket (1,09 g, 92%) világos narancssárga szilárd anyagként kapjuk. (Pet. éter 70%: EtOAc 30%): 0,84. Mpt: 176-180°C; UV-Vis (MeOH) : 386 nm. Infravörös (tiszta) υmax (cm-1): 3334 (OH), 3267 (NH), 3059 (C = CH), 1583 (ArC = C), 759 (ArH) 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,25 (1H, H-C3′, s, ArOH), 9,98 (1H (C1), s, NH), 9,11 (1H H-C3, s, ArH), 8,34-8.36 (1H, H-C1′, s, N = CH), 8,33 (1H, H-C5, d, J = 4,0, ArH), 7,61-7,58 (1H, H-C6, d, J = 4,0, ArH), 7.31 (1H, H-C6′, m, ArH), 7,25 (1H, H-C4′, m, ArH), 7,24 (1H, H-C7, m, ArH), 6,95 (1H, H-C5′, m, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 157,9, 151,3, 132,9, 131,4, 130,6, 123,7, 120,3, 117,2, 116,9, 115,3 ppm. HRMS (ESI): m/z számítva + C13H10N4O5-re: 302,2400, találtuk: 301.0000.

2.1.6. 4-(2-(2-(2, 4-Dinitrofenilhidrazono) metil) benzol-1, 3-diol

2, 4-Dinitrofenilhidrazin (0,69 g, 3,48 mmol, 1 ekv.) 2, 4-dihidroxi benzaldehid (0,50 g, 1,04 ekv.) jelenlétében, 3,62 mmol) adta a nyers terméket, amelyet forró etanolból történő átkristályosítással tisztítottunk, így a terméket (0,66 g, 2,07 mmol, 60%) sötétvörös szilárd anyagként kaptuk. (Pet. éter 70%: EtOAc 30%): 0,51. Mpt: 270-274°C; UV-Vis (MeOH) : 403 nm. Infravörös (tiszta) υmax (cm-1): 3364 (OH), 3094 (C = CH), 1612, 1584 (ArC = C) 592 (ArH). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 11,58 (1H, H-C3′, s, ArOH), 10,11 (1H, H-C1, s, NH), 9,94 (1H, H-C5′, s, ArOH), 8,87 (1H, H-C3, s, ArH), 8,86 (1H, s, N = CH), 8.33 (1H, H-C4′, s, ArH), 8,36 (1H, H-C5, d, J = 12,0, ArH), 7,95-7,97 (1H, H-C6, d, J = 8,0, ArH), 7,54 (1H, H-C7, m, ArH), 6,38 (1H, H-C6′, d, J = 8,0, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz, DMSO-d6) 161,8, 159,1, 148,2, 144,6, 136,7, 130,1, 129,3, 128,8, 123,6, 116,9, 112,0, 108,7, 102,1 ppm.

2.2. A vegyületek antimikrobiális értékelése

2.2.1. A vizsgálati szervezetek forrása

A Staphylococcus aureus (SA) (ATCC 25923), az Escherichia coli (EC) (ATCC 25922) és a Pseudomonas aeruginosa (PA) (ATCC 27853) tiszta tenyészeteit a Kwame Nkrumah University of Science and Technology (KNUST), Kumasi, Gyógyszerészeti és Gyógyszerésztudományi Kar Gyógyszerészeti Tanszékének Mikrobiológiai Osztályától kaptuk. A Klebsiella pneumoniae (KP), a Candida albicans (CA) és a Streptococcus pneumoniae (SP) azonban a Komfo Anokye Oktatókórházból (Kumasi) származó klinikai törzsek voltak, amelyeket a KNUST Gyógyszerészeti Tanszékén tenyésztettek.

2.2.2. A Klebsiella pneumoniae (KP), a Candida albicans (CA) és a Streptococcus pneumoniae (SP) klinikai törzsek. A minimális gátló koncentráció (MIC)

A hidrazon-származékok és a referencia gyógyszerek, a ciprofloxacin és a flukonazol minimális gátló koncentrációinak (MIC) meghatározásához mikrohígítási módszert alkalmaztunk. A 96 lyukú mikrotiterlemezeket 125 µl kétszeres erősségű tápoldattal töltöttük meg, és a hidrazon-származékok különböző koncentrációit adtuk hozzá. A referencia gyógyszerek a 12.5 µL/mL és 40 µL/mL között hasonlóan kezelték. Minden lyukba 1 × 105 cfu/mL tesztorganizmus aliquotját adtuk. A kontrolllemezt csak tápoldattal és tesztorganizmusokkal töltöttük meg. A teszt- és kontrolllemezeket 37 °C-on inkubáltuk (baktériumok esetében 24 órán át, gombák esetében 48 órán át), majd 20 µl 1,25 mg/ml 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium-bromidot (MTT) adtunk minden egyes mélyedésbe. Megfigyeléseket végeztünk 20 perc elteltével a növekedést jelző lila elszíneződésre vonatkozóan. A hidrazon-származékok és a referencia hatóanyagoknak azt a legkisebb koncentrációját tekintettük MIC-értéknek, amely nem mutatott színváltozást a lyukakban. A meghatározásokat ismétlésekben végeztük el.

2.2.3. Rezisztens modulációs vizsgálatok

A modulációs vizsgálatokhoz a 96 lyukú tányérokat 125 µl kétszeres erősségű tápoldattal töltöttük meg, és ugyanennyi 40 µl fenilhidrazont adtunk hozzá. A ciprofloxacin és a flukonazol különböző koncentrációit 50 µL/ml és 7,812 µL/ml, illetve 15,625 µL/ml és 7,812 µL/ml közötti tartományokban adtuk hozzá. Minden egyes mélyedésbe 25 µl 1 × 105 cfu-t tartalmazó tesztorganizmust adtunk, majd a lemezeket 37 °C-on inkubáltuk (24, illetve 48 órán át a baktériumok és a gombák esetében), majd minden egyes mélyedésbe 20 µl MTT-t adtunk. A színváltozás megjelenését a zavaros kutakból lilára történő színváltozást regisztráltuk, és csak a referencia gyógyszerek MIC-értékeivel hasonlítottuk össze . A meghatározásokat ismétlésekben végeztük el.

3. Eredmények és megbeszélés

3.1. Eredmények és megbeszélés

3.1. Eredmények és megbeszélés. A fenilhidrazonok szerkezeti elemzése

A vegyületek szintéziséhez alkalmazott szintetikus útvonal az aldehidek vagy ketonok és hidrazinok közötti standard kondenzációs reakciót követte, figyelembe véve az építőelemek kereskedelmi elérhetőségét (1. séma). A retroszintetikus szétkapcsolási megközelítés lehetővé tette, hogy a kívánt vegyületek szintéziséhez kulcsfontosságú köztitermékként különböző aldehideket és egy ketonokat azonosítsunk. A folyamat során a 2,4-dinitrofenilhidrazin sebességmeghatározó aromás nukleofil támadása történik a karbonilon savas oldatban. Ezt követte a reaktív köztitermék dehidratálása, így kaptuk a végterméket, a 2, 4-dinitrofenil-fenilhidrazon származékot.

A szintetikus eljárások adatait a kísérleti rész tartalmazza, és a sorrend szerint értelmezzük: olvadáspont tartomány (Mpt.) Celsius-fokban (°C), az ultraibolya-látható spektrum maximális abszorpciójának hullámhossza, infravörös spektrum, 1H NMR , 13C NMR és HRMS, mint az SA5 (5. vegyület) (az egyik legaktívabb vegyület) megerősítő eszköze.

3.1.1. Az SA5-ös vegyület (5. vegyület) és a HRMS mint az egyik legaktívabb vegyület. UV-Vis spektroszkópia

A kiegészítő információkban szereplő BP1 megerősítő eszközeként mind a hat vegyület spektrumát meghatároztuk mind az ultraibolya, mind a látható hullámhosszon (200-800 nm), metanol mint vakanyag felhasználásával. A szintetizált fenilhidrazonok elektronikus spektrumában kapott 203 nm-nél és 403 nm-nél lévő abszorpciós sávok olyan átmeneteknek tulajdoníthatók, amelyekhez a fenilhidrazonok különböző szubsztituens auxokrómjai járulnak hozzá. A fenilhidrazonokról ismert, hogy az UV-látható tartományban különböző hullámhosszakon abszorbeálódnak .

A BP1 vegyület például metanolban oldva és az UV-látható tartományban vizsgálva 203 nm-en, 314 nm-en és 382 nm-en mutatott abszorpciót, ami a fenilhidrazonokban a benzofenon és a 2,4-dinitrofenilhidrazin összekapcsolását követő kiterjedt konjugációnak tulajdonítható. A BP1 vegyület azonban 382 nm-en mutatott maximális abszorpciót, ami a konjugáció fokozódásának tulajdonítható. A BA2, MHB3, VL4, SA5 és DHB6 vegyületek is 378 nm-en, 392 nm-en, 394 nm-en, 386 nm-en és 403 nm-en mutattak maximális abszorpciót, amint az az alátámasztó információkban megfigyelhető.

A kiterjedt konjugáció a fenilhidrazonokban lévő kromofórák jelenlétének tulajdonítható, amelyek közé tartozik a BP1 (két aromás gyűrűs kromofór), az MHB3 (metahidroxi- auxochrom), a VL4 (egy hidroxi- és metoxi- auxochrom), az SA5 (ortohidroxi- auxochrom) és a DHB6 (két hidroxi- auxochrom). Ez arra utal, hogy az auxokrómokkal és extra kromofórral rendelkező hidrazonoknál a konjugáció kiterjedt, ami jobbra tolódáshoz (bathokróm eltolódáshoz) vezet.

3.1.2. Infravörös spektroszkópia

Az infravörös spektrum képet ad a vegyületben lévő funkciós csoportokról. Az 5. vegyület mint minta infravörös spektrumából a 3300 cm-1 körüli tartományban megnyúló és a 3000 cm-1 körüli alifás CH tartományba lejtő széles sáv jelenléte egy hidroxifunkciós csoport jelenlétére utal, ebben az esetben egy fenoléra, amint az a kísérő információkban megfigyelhető.

Az IR-spektrumból (kiegészítő információk) az is megfigyelhető volt, hogy az olyan vegyületek, mint az MHB3, VL4, SA5 és DHB6 éles, erős csúcsot mutattak a C = C nyújtási sávjukban az 1138-1620 cm-1 tartományban, szemben a BP1 és BA2 vegyületekkel, amelyek nem rendelkeznek hidroxifunkcióval, amint az az 1. táblázatban látható. A hidrazin és a karbonilok közötti kondenzációs reakcióból keletkező C = N jelenlétét átfedték a benzolban lévő aromás sp2 hibridizált szénatomok (C = C), amelyek az 1138-1640 cm-1 tartományban rezegnek a szubsztituenskötésektől függően. Mivel a C = N rezgési frekvenciák 1580-1600 cm-1 közé esnek, sávjaik nem különböztethetők meg egyértelműen aromás C = C megfelelőik jelenlétében, amint azt a kísérleti adatok mutatják.

3.1.3. Táblázat. Nukleáris mágneses rezonancia (NMR) spektroszkópia

Mind a hat szintetizált fenilhidrazon esetében NMR-meghatározásokat végeztünk egydimenziós (1D) NMR-technikával (1H és 13C) és kétdimenziós NMR-technikával, torzításmentes fokozás polarizációs transzferrel kvaterner szénatomokra (DEPT-Q). Ezeket az adatokat a kísérleti részben minden egyes vegyülethez hozzárendeltük. A szerkezeteket a BP1, BA2, MHB3, VL4, SA5 és DHB6 vegyületek 1H NMR, 13C NMR és DEPT-Q spektrumadataival igazoltuk, amint az a kiegészítő információkban látható. A DHB6-ot (6. vegyület) figyelembe véve (2. ábra, 1. táblázat), és a proton NMR (kiegészítő információk) alapján a messze lentebb rezonanciát mutató kémiai eltolódás a hidroxiproton jelenlétét jelezte szinglet jellel. Ez az elektronegatív oxigén fokozott árnyékoló hatása miatt lejjebb rezonált, mint a másodlagos aminproton. Ez a kémiai eltolódás kissé magasabb volt, mint a hidroxilcsoporté ( 9,94 ppm), mivel az előbbi közelebb van az iminkötés elektronegatív nitrogénatomjának kémiai környezetéhez. Ezért az első hidroxi-szingulett jelet 11,54 ppm-nél a nitrogéncsoport elektronegativitása miatt a másik hidroxi-jel előtt egy szingulett jel követte 10,11-nél a másodlagos aminoproton szingulett jele. A két elektronegatív nitrocsoport közé szorított aromás proton volt a következő jel, amely 8,86 ppm-nél rezonált. Ezt követte a tercier aminocsoporthoz közeli proton. Az iminprotonhoz kapcsolódó tercier aminocsoport az iminprotonok árnyékolását és 8,86 ppm-nél lefelé irányuló rezonanciáját okozta egy szingulett jellel. A para-pozícióban lévő nitrocsoporthoz legközelebbi magányos proton volt a következő jel a 7,95-7,97 ppm-nél lévő doublet-csúccsal. A kevésbé elektronegatív másodlagos aminocsoporthoz legközelebbi másik magányos proton szintén dublett jelet adott 7,64-7,66 ppm-en. A két másik magányos proton (az egyik a diol között, a másik orto az imin kötéshez képest) 7,52-7,54 ppm-nél adott multiplett jelet, míg a para-hidroxi-csoporthoz legközelebbi proton és az imin csoporttól két szénkötéssel távolabb lévő proton 6-nál adott dublett jelet.38 ppm.

2. ábra

A DBH6 (6. vegyület) kémiai szerkezete .

DEPT-Q-t használtunk az elsődleges, másodlagos, harmadlagos és kvaterner szénatomok megkülönböztetésére. A DEPT-Q-ban a metil (CH3) és a metin (CH) jelek a pozitív fázisban felfelé, míg a metilén (CH2) és a kvaterner jelek a negatív fázisban lefelé jelennek meg. A DHB6 DEPT-Q spektruma (kiegészítő információk) felfelé irányuló szénjelek jelenlétét mutatja, amelyek ebben az esetben csak hat metin-szénhidrogént képviselnek, és a 161,8, 159,1, 148,2, 136,7, 130,1 és 112,0-nál jelennek meg, megerősítve az aromás metin-szénhidrogént és hét kvaterner szénhidrogént a 148,2, 130,1, 129,2, 123,6, 116,9, 108,7 és 102,9-nél. A többi vegyület DEPT-Q-ja megtalálható a kiegészítő információkban.

3.1.4. Tömegspektroszkópia

A tömegspektroszkópiát a pontos molekulatömegek meghatározására és a vegyületek fragmentálására használják ionizációs technikák segítségével . Az SA5 fenilhidrazon vegyület volt az egyik legaktívabb vegyület az antimikrobiális értékelés után. Az elektrospray ionizációs (ESI) tömegspektrumból a molekulaion-csúcs negatív módban 301,0000 (M-H+) volt, ami a tényleges tömeg, amely 0,24 (0,41%) tűréshatárral tér el a 302,2400 elméleti tömegtől. Ez megerősítette az SA5 vegyület molekulatömegét.

A tömegspektroszkópiát az egyik legaktívabb vegyület molekulatömegének megerősítésére használtuk, ezért a többi vegyületre nem alkalmaztuk.

4. Antimikrobiális értékelés

4.1. Az antimikrobiális hatás értékelése

. Minimális gátló koncentrációk (MIC)

A minimális gátló koncentráció (MIC) egy antimikrobiális szer legkisebb koncentrációja, amely 24 órás (baktériumok) és 48 órás (gombák) inkubáció után gátolja a kórokozó látható növekedését . A fenilhidrazonok és két standard antibiotikum (ciprofloxacin és flukonazol) MIC-értékeit mikrohígítási teszttel értékelték hat patogén mikroorganizmusból álló panellel szemben:

Minden vegyület gyenge antimikrobiális aktivitást mutatott a vizsgált szervezetekkel szemben a 2. táblázatban megfigyelt vizsgálati koncentrációkban. A BP1 mutatta a legmagasabb antimikrobiális aktivitást a hat vegyület közül a kiválasztott tesztorganizmusokkal szemben. A BA2 azonban a legkisebb antimikrobiális aktivitást mutatta 699 µM MIC értékkel az összes vizsgált organizmussal szemben. Az MHB3 MIC értéke 562 µM volt a C. albicans ellen, és 662 µM vagy annál magasabb a többi vizsgált organizmus ellen. A VL4 602 µM MIC értéket mért az összes vizsgált szervezet ellen, kivéve a S. pneumoniae-t (MIC = 300 µM). Az SA5 MIC-értéke az S. pneumoniae és a K. pneumoniae ellen 165 µM és 331 µM volt, míg az S. aureus, az E. coli, a P. aeruginosa és a C. albicans esetében magasabb, 662 µM MIC értéket mutatott. A DHB6 az S. pneumoniae, K. pneumoniae és C. albicans ellen 314 µM MIC értékkel mutatott aktivitást, míg az S. aureus, E. coli és P. aeruginosa esetében a MIC értéke 628 µM és magasabb volt. Az alkalmazott antibakteriális referencia hatóanyag a ciprofloxacin volt, és a P. aeruginosa, S. pneumoniae és K. pneumoniae ellen 2,36 µM, míg a S. aureus és az E. coli ellen 4,72 µM MIC értéket mértek. Az alkalmazott referencia gombaellenes gyógyszer a flukonazol volt, és a kapott MIC 327 µM volt a C. albicans ellen. A fenilhidrazonok MIC értéke a két Gram-negatív organizmus ellen 552 µM és 699 µM között mozgott, míg a standard ciprofloxaciné 4,72, illetve 2,36 µM volt (2. táblázat).

4.2. táblázat. Rezisztenciamodulációs aktivitás

A rezisztenciamodulációs teszttel vizsgáltuk, hogy a fenilhidrazonok szub-MIC-eknél hajlamosak-e javítani néhány kereskedelmi forgalomban kapható antibiotikum aktivitását ismert rezisztens törzsekkel szemben. A 2. és 3. táblázat alapján a BP1 (1. vegyület) 50 µM szub-MIC értékkel S. pneumoniae ellen a ciprofloxacin MIC értékét 2,36-ról 1-re csökkentette.078 µM, ami a ciprofloxacin MIC-értékének 54,32%-os csökkenését jelenti. A BP1 szintén javította a ciprofloxacin teljesítményét K. pneumoniae ellen 50 µM alatti MIC-értéknél 2,36 µM-ről 1,078 µM-re, ami az antibiotikum MIC-értékének 54,32%-os csökkenését jelenti. A BP1 szintén módosította a flukonazol C. albicans elleni aktivitását 327 µM-ról 2,156 µM-ra, ami a flukonazol MIC-értékének 99,34%-os csökkenését jelenti. Hasonlóképpen, a BA2 javította a ciprofloxacin S. pneumoniae elleni aktivitását, és a ciprofloxacin MIC-értékét 2,36 µM-ről 1,36 µM-ra csökkentette, ami 42,37%-os csökkenést jelent. Ezenkívül a BA2 módosította a flukonazol C. albicans elleni aktivitását is 50 µM alatti MIC-értéknél, és a MIC-érték 327 µM-ről 1,23 µM-ra csökkent, ami a MIC-érték 99,6%-os csökkenését jelzi.

MHB3 modulálta a ciprofloxacin S. pneumoniae és Klebsiella pneumoniae elleni aktivitását, ami az antibiotikum MIC értékének 2,36-ról 1,29 µM-ra történő csökkenését okozta. Ez a MIC-csökkenés 45,33%-os csökkenést jelzett. Az MHB3 a flukonazol aktivitásának modulációját is kimutatta 50 µM alatti MIC értéken a Candida albicans ellen, és a MIC értéket 327 µM-ről 5,109-re csökkentette, ami 98,43%-os maximális csökkenést jelez. A VL4 javította a ciprofloxacin teljesítményét 50 µM alatti MIC-nél S. pneumoniae és K. pneumoniae ellen. Az antibiotikum MIC-értéke mindkét esetben 2,36-ról 1,176 µM-ra csökkent. Ez a MIC-csökkenés 50,17%-os csökkenést jelentett. A VL4 ismét modulálta a fluconazol teljesítményét 50 µM szub-MIC értéken a C. albicans ellen, és 327 µM-ről 1,176 µM-re csökkentette a MIC értéket, ami 99,64%-os maximális csökkenést mutatott.

Az 5. vegyület (SA5) továbbá modulálta a ciprofloxacin aktivitását 50 µM szub-MIC értéken a S. pneumoniae és a K. pneumoniae ellen. A MIC mindkét esetben 2,36-ról 1,29 µM-ra csökkent, ami 45,34%-os csökkenést eredményezett. Az SA5 ismét módosította a fluconazol teljesítményét 50 µM sub-MIC értéken a C. albicans ellen, és a MIC értékét 327 µM-ről 1,29 µM-ra csökkentette, ami jó, 99,61%-os csökkenést jelez. A DHB6 (6. vegyület) szintén módosította a ciprofloxacin S. pneumoniae és K. pneumoniae elleni aktivitását 50 µM alatti MIC értéken, és mindkét esetben 2,36-ról 1,23 µM-ra csökkentette a MIC értéket, ami a MIC érték 47,88%-os csökkenését jelenti. A DHB6 szintén módosította a flukonazol aktivitását 50 µM alatti MIC értéken a C. albicans ellen, és a MIC értékét 327 µM-ről 1,23 µM-re csökkentette, ami a MIC érték 99,62%-os csökkenését jelenti. Az SA5 és a BP1 jobb volt a másik négy fenilhidrazonnál a rezisztenciamoduláló hatás tekintetében a ciprofloxacinnal együtt, amelynek MIC értéke 2,58 µM volt a P.aeruginosa ellen, amelyet a BP1 (17,2 µM) követett. Ezért az SA5-ben lévő ortohidroxi-csoport és az aromás ketoncsoport jelenléte lényeges lehet a ciprofloxacinnal kombinált rezisztenciamoduláló hatáshoz a Gram-negatív P.aeruginosa és E. coli ellen. Továbbá a metahidroxi-csoport (MHB3), a hidroxi- és metoxi-csoport (VL4) jelenléte, valamint a BA2 benzaldehidrészén lévő szubsztituens hiánya szintén javította az aktivitást, és megfontolandó a jövőbeli gyógyszerfejlesztés szempontjából. A másik súlyos fertőzéseket okozó Gram-negatív ellenfél, a K. pneumoniae érzékenyebb volt a fenilhidrazonokra 138 és 699 µM között. A fenilhidrazonok szubinhibitorikus koncentrációinak ciprofloxacinnal való kombinálásával a K. pneumoniae rezisztenciahatára csökkent, ami 5,46 µM-ról jóval alacsonyabb, 1,078-as MIC értéket tett lehetővé, ami a P. aeruginosa és az E.coli.

A fenilhidrazonok hasonló aktivitást mutattak a Gram-pozitív szervezetekkel szemben 87,3 és 699 µM között, ami szintén nyilvánvaló a Staphylococcus aureus és a Streptococcus pneumoniae rezisztenciális tulajdonságairól.

5. Következtetés

Egy hat új fenilhidrazont tartalmazó könyvtárat sikeresen szintetizáltunk és jellemeztünk: Az 1-(2, 4-dinitrofenil)-2-(difenilmetil)hidrazin , 1-benzilidén-2-(2, 4-dinitrofenil)hidrazin , 3-(2-2-(4-dinitrofenil)hidrazono)metilfenol, 4-(2-(2-(2, 4-dinitrofenil) hidrazono) metil)-2-metoxifenol , (Z)-2-(2, 4-dinitrofenil) hidrazono) metilfenol , és 4-(2-(2-(2, 4-dinitrofenilhidrazono) metil) benzol-1, 3-diol.

A jövőbeli gyógyszertervezés és -optimalizálás részeként a fenilhidrazonok a szintetizálhatóságuk és jó hozamuk miatt szerkezeti gerincnek tekinthetők. A vegyületek gyenge antimikrobiális tulajdonságot mutattak, de a standard gyógyszerekkel kombinálva erős rezisztenciamoduláló hatást mutattak. A standardok aktivitása jelentősen javult a MIC-értékek jó csökkenésével.

Rövidítések

Adatok elérhetősége

A kutatás adatai a Kwame Nkrumah University of Science and Technology, Pharmaceutical Chemistry Department, Faculty of Pharmacy archívumában állnak rendelkezésre.

Conflicts of Interest

A szerzők nem nyilatkoznak érdekellentétről a cikk publikálásával kapcsolatban.

A szerzők hozzájárulása

A.A., A.B., I.A., Y.D.B., C.D.K.A. és B.K.H. fogalmazták meg a kutatómunkát és készítették el a kéziratot. C.D. K.A., A.B. és A.A. tervezte és végezte a vegyületek szintézisét. C.D.K.A., A.A. és I.A. kidolgozta a koncepcionális keretet és elkészítette a kéziratot. C.D.K.A. és B.K.H. értelmezte a spektrális eredményeket és elvégezte a szerkezetfelvilágosítást. Y.D.B. és A.A. végezték az in vitro antimikrobiális vizsgálatot és szolgáltatták annak kísérleti adatait és az eredmények értelmezését.

Köszönet

A szerzők nagyon hálásak a KNUST, Kumasi, Ghána, Gyógyszerészeti Kar, Gyógyszerészeti Kémiai Tanszék, KNUST, Kumasi, Ghána, összes munkatársának és technikusának a támogatásukért. A szerzők nagyra értékelik Francis Amankwah úrnak a KNUST Gyógyszerészeti Tanszékéről (Mikrobiológiai Szekció) a technikai támogatásért.

Kiegészítő anyagok

A kiegészítő fájl tartalmazza az összes spektrumot. (Kiegészítő anyagok)