2,4-Dinitrophenylhydrazone Derivativesの合成と抗菌抵抗性調節活性：ESKAPEヒト病原体に対する薬剤として

Abstract

6種の新規フェニルヒドラゾンのライブラリを合成し、グラム陽性、グラム陰性および真菌種のパネルに対するin vitro抗菌活性および抵抗性調節活性について評価した。 化合物は60-92% w/wの良好な収率で合成され，融点，紫外可視分光法，赤外，核磁気共鳴法（1H，13C，DEPT-Q）により特性評価を行った。 また、最も活性の高い化合物の 1 つである 5 は、質量分析により同定された。 フェニルヒドラゾンは6種の微生物すべてに活性を示し，最も活性の高い化合物1および5の最小発育阻止濃度（MIC）は，それぞれ138 μM（Klebsiella pneumoniae）および165 μM（Streptococcus pneumoniae）であった． また，化合物1はStreptococcus pneumoniaeとKlebsiella pneumoniaeに対して1.078 µMと高い耐性調節活性を示した

1. はじめに

ここ数十年、世界では多剤耐性菌の増加により、有効な抗生物質が不足しつつあります。 このため、科学者たちは、これらの感染症やその結果として起こる病気を抑制するための新しい抗菌薬として、活性のある化合物の類似体やリード化合物を合成する可能性を絶え間なく探求することが求められています。 感染症は何世紀にもわたって人類の生存を脅かす大きな脅威となり、社会に大きな影響を与え続けている。 細菌、ウイルス、真菌、寄生虫などの病原体は、それらを抑制するためのいくつかの試みにもかかわらず、特に21世紀に入ってから出現し、急増している。 感染症は、年間約1700万人の命を奪い、少なくとも30種類の新しい病気が出現している。 現在、世界はコロナウイルスによるパンデミックCOVID-19と戦っており、3ヶ月の間に世界中ですでに25,000人以上の命が奪われている（WHO, 2020）。 これらの病気は、特に治療法やワクチンが存在しないため、何百万人もの人々の健康を脅かしています。 微生物感染症が増加傾向にあるのは、抗菌薬耐性という長年の問題が大きく影響しています。 抗菌薬耐性の主な原因は、長期間の化学療法や投与法の不遵守などです。

抗生物質に対する耐性が高まるにつれ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA) や多剤耐性結核菌 (MDR-TB) 、多剤耐性大腸菌 (MDR-Escherichia Coli) などの病原体が増加傾向になりました。 さらに、院内感染の治療で最も懸念されているのが、ESKAPE病原体（Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, and Enterobacter species）である。 これらの菌株の多くは多くの抗生物質に耐性を示すため、感染症におけるこれらの菌株の存在は医療分野において憂慮すべき状況であり、これらの菌株の耐性メカニズムを理解することは新規抗菌薬の開発に有用である。

世界保健機関は、農村から都市への移住、世界人口の増加、微生物の適応、気候変動など多くの要因により感染症の増加傾向が続くと明言している 。 そのため、抗菌化学者を含む関係者は、抗菌剤耐性の脅威を克服するための新しい化学療法剤を発見する戦略を立てることが常に求められている。 化合物の耐性調節活性とは、既に知られている基準に、特にポジティブな形で影響を与える化合物の能力である。 抗生物質に対する微生物の耐性が高まっているため、天然または合成由来の薬剤が、アモキシシリン（a）、シプロフロキサシン（b）、フルコナゾール（c）などの標準的な抗菌剤の活性を調節しているようです（図1）。

近年、標準的な抗生物質に対する製品（天然および合成）の耐性調節活性が科学的に関心を集めています。 これは、微生物耐性の抑制に大きな進歩をもたらす抗菌力の最大化を目的とし、それゆえ潜在的な創薬につながるものである。 そのような合成剤の中で、耐性菌抑制効果が期待できる重要なクラスがヒドラゾン類です。 ヒドラゾン類とその類縁体は、アゾメチン官能基を持ち、幅広い生物活性を持つ重要な化合物群です。 ヒドラゾン類は、抗けいれん作用、抗炎症作用、抗菌作用、抗原虫作用、抗がん作用など、幅広い薬理活性を有することから選択された。 ヒドラゾンは生物学だけでなく、光化学、分析化学、無機化学の分野でも重要な役割を担っている。 ヒドラゾンは、ケトンやアルデヒドの酸素を-NNH2官能基で置換したもので、ケトンとアルデヒドの関係にある。 様々な合成プロトコルと詳細な構造活性相関（SAR）研究により、様々なヒドラゾン誘導体が開発され、様々なターゲットに薬理活性を示すことが発見されています。 イソニコチノイルのヒドラゾン誘導体には、抗結核活性を有するものがあることが判明した。 また、安息香酸ヒドラゾン誘導体の4-hydroxybenzoic acid -hydrazide (nifuroxazide) は腸管虫に対して活性を示し、4-fluorobenzoic acid -hydrazide は Staphylococcus aureus ATCC 29213 に対して 3.13 μg/mL で、感受性結核菌 H37RV にも 3.13 μg/mL の抗菌活性があることが明らかになった。 また，最近合成されたNifuroxazideを含むヒドラゾン類は，最小発育阻止濃度0.78～6.25 μg/mlで結核菌H37RVに対して活性を示した． また、新規薬剤である3, 5-dibenzoylvanillin hydrazoneと遷移金属錯体が優れた抗菌活性を示すことがわかった。

そこで本研究では、求核縮合反応により6種の新規フェニルヒドラゾン誘導体を合成し、抗菌活性と耐性調節効果を検討した。 材料と方法

2.1. 合成 一般的な材料と方法

磁気撹拌棒を備えた丸底フラスコ（100 mL）に、氷浴に保ったメタノール（10 mL）中の2，4-ジニトロフェニルヒドラジン（1 eq）を投入した。 得られた懸濁液を撹拌し、0℃に冷却した後、濃H2SO4 (98% v/v, 2 mL)を滴下し、淡黄色溶液を得た。 室温まで冷却後、メタノール(5 mL)中のアルデヒドまたはケトン誘導体(1.04 eq.) を加え、徐々に沈殿物が形成されるまで混合物を撹拌し、24時間静置した。 化学反応の進行は、シリカゲル（60 GF254）でコーティングしたアルミニウムプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（TLC）により断続的に観察した。 プレートは254 nmと366 nmのUV光で可視化し、その後、スポットの同一性確認のためにアニスアルデヒドを噴霧して確認した。 粗生成物を吸引ろ過でろ過し、熱した絶対エタノール（96% v/v）から再結晶した。 吸引濾過により固体生成物を得て、乾燥し、室温で保存した。

合成した化合物の構造は、赤外線（IR）および紫外線可視（UV-Vis）分光技術の支援による融点決定、質量分析、1D NMR（プロトンおよび炭素13）および2D NMR（DEPT-Q）分光法で確立した.

2.1.1. 1-（2，4-ジニトロフェニル）-2-（ジフェニルメチレン）ヒドラジン

2，4- ジニトロフェニルヒドラジン（0．50 g, 2.74 mmol, 1 eq． ベンゾフェノン（0．53 g, 1.04 eq., 2.64 mmol）の存在下で粗製品を得、熱エタノールからの再結晶により精製して、生成物を淡橙色固体として得た（0.84 g, 85％）。 (ペットエーテル 70％: EtOAc 30％): 0.90. Mpt: 141-143°C; UV-Vは(MeOH) : 382 nm。 赤外線（ニート） υmax cm-1： 3382（OH）、3286（NH）、1586（C = CH）、848、614（ArH）。 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 11.24 (1H, H-C1, s, NH), 9.09-9.10 (1H, H-C3, s, ArH), 8.41 (1H, H-C5, d, J = 2.4, ArH), 8.37-8.38 (1H, H-C6, m, ArH), 7.66-7.72 (5H, H-C4′, H-C5′, H-C6′, H-C5′, H-C3′, m, ArH), 7.35 (3H, H-C5′, H-C4′, m, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz; CDCl3) 155.7, 145.1, 136.5, 131.9, 130.5, 130.4, 130.1, 129.9, 128.6, 128.2, 127.9, 123.4, 116.6 ppm.

2.1.2. 1-ベンジリデン-2-（2，4-ジニトロフェニル）ヒドラジン

2, 4-ジニトロフェニルヒドラジン（0.90 g, 4.53 mmol, 1 eq.) をベンズアルデヒド (0.50 g, 1.04 eq., 4.71 mmol) の存在下に置いて粗製品が得られ、熱エタノールからの再結晶により精製して、製品 (1.01 g, 78%) を黄色固体として得ることが出来た。 (ペットエーテル 70％: EtOAc 30％): 0.83. Mpt: 178-180°C; UV-V は (MeOH) : 224 nm と 378 nm。 赤外線（ニート）υmax cm-1： 3337（OH）、3283（NH）、3100（C＝CH）、1618、1584（ArC＝C）。 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11.24 (1H, H-C1, s, NH), 9.09 (1H, H-C3, s, ArH), 8.30-8.31 (1H, H-C1′, s, N = CH), 8.05 (1H, H-C5, m, ArH), 8.02 (1H, H-C6, m, ArH), 7.41-7.69 (2H, H-C2′, H-C6′, m, ArH), 7.40 (1H, H-C4′, m, ArH), 7.39 (2H, H-C3′, H-C5′, m, ArH)となった。 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 147.9, 145.8, 144.9, 144.7, 131.0, 130.0, 129.0, 127.6, 123.5, 116.8 ppm.

2.1.3. 3-（2-2-（4-ジニトロフェニル）ヒドラゾノ）メチルフェノール

2, 4-ジニトロフェニルヒドラジン（0.78 g, 3.93 mmol, 1 eq）の存在下に、m-ヒドロキシベンズアルデヒド（0.50 g, 1.04 eq, 4.09 mmol）から粗生成物を得、これを熱エタノールから再結晶することにより精製し、生成物 (0.76 g, 64%) を暗赤色固体として得た。 (ペットエーテル70％：EtOAc30％）：0.74。 Mpt: 277-280°C. UV-Vis (MeOH) : 392 nm。 赤外線（neat）υmax cm-1：3420（OH），3257（NH），3116（C = CH），1607，1584（ArC = C）。 1H NMR（400MHz，CDCl3） 11.56（1H，H-C1，s，NH），10.04（1H，H-C2′，s，ArOH），8.88（1H，H-C3，s，ArH），8.86（1H，H-C7，s，N＝CH），8.35-8.37（1H H-C5，d，J＝8.0、ArH), 8.08-8.34 (1H, H-C6), d, J = 12.0, ArH), 8.05 (1H, H-C5′, m, ArH), 7.66 (1H, H-C1′, s, ArH), 7.14 (1H, H-C4′, m, ArH), 6.87-6.89 (1H (H-C3′, m, ArH))． 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 160.5, 150.5, 144.9, 137.1, 130.2, 129.8, 129.5, 125.2, 123.6, 117.1, 116.4 ppm.

2.1.4. 4-（2-（2，4-ジニトロフェニル）ヒドラゾノ）メチル）-2-メトキシフェノール

2，4-ジニトロフェニルヒドラジン（0．78g、3．93mmol、1eq）存在下に4-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒド（バニリン）(0．50g、1．04eq．) 4.09 mmol）から粗生成物を得、これを熱エタノールからの再結晶により精製し、生成物 (0.91 g, 70 %) を明るい赤色の固体として得た。 (ペットエーテル 70％: EtOAc 30％): 0.66. Mpt: 270-273°C. UV-Vis (MeOH) : 218 nm および 394 nm。 赤外線（neat） υmax cm-1： 3363（OH）、3274（NH）、3111（C＝CH）、1605（ArC＝C）、699（ArH）。 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11.58 (1H, s, NH), 10.11 (1H, H-C4′, s, ArOH), 9.94 (1H, H-C3, s, ArH), 8.87 (1H, H-C5, s, ArH), 8.86 (1H, H-C7, s, N = CH), 8.35 (1H, H-C6, d, J = 4.H, N = CH), 8.58 (1H, H-C5, s, ArH), 8.87 (1H, H-C6, d, J = 2.H, N = CH)0, ArH）, 7.97（1H, H-C2′, d, J = 4.0, ArH）, 7.66-7.76（1H, H-C6′, d, J = 8.0, ArH）, 6.38-6.35（1H, H-C5′, d, J = 12.0, ArH）, (3H, H-C4′, Ar-OCH3). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 150.7, 150.2, 148.6, 144.9, 137.1, 130.2, 125.6, 123.6, 123.1, 117.2, 116.1, 110.3, 56.2 ppm.

2.1.5. (Z)-2-(2, 4-ジニトロフェニル)ヒドラゾノ）メチルフェノール

2, 4-ジニトロフェニルヒドラジン (0.78 g, 3.93 mmol, 1 eq.) 存在下にサリチルアルデヒド (0.50 g, 4.09 mmol, 1.04 eq.) から粗製品を得て、熱エタノールからの再結晶により精製して明るいオレンジ色の固体として本製品 (1.09 g, 92%) を得ることができた。 (ペットエーテル 70％: EtOAc 30％): 0.84. Mpt: 176-180°C; UV-Vis (MeOH) : 386 nm。 赤外線（neat）υmax（cm-1）：3334（OH）、3267（NH）、3059（C＝CH）、1583（ArC＝C）、759（ArH）1H NMR（400MHz、CDCl3）11.25（1H、H-C3′、s、ArOH）、9.98（1H（C1）、s、NH）、9.11（1H H-C3，s，ArH）8.34-8.5（1H H-C3，s，ArH）8.5（1H C1，s，Arh）1H NMR（1H C3，s，ArH）1H NMR（1H C1，s，Arh）1H NMR（1H C3，s，Arh36 (1H, H-C1′, s, N = CH), 8.33 (1H, H-C5, d, J = 4.0, ArH), 7.61-7.58 (1H, H-C6, d, J = 4.0, ArH), 7.61-7.58 (1H, H-C5, s, N = CH), 7.31 (1H, H-C6′, m, ArH), 7.25 (1H, H-C4′, m, ArH), 7.24 (1H, H-C7, m, ArH), 6.95 (1H, H-C5′, m, ArH) ppm.であった。 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 157.9, 151.3, 132.9, 131.4, 130.6, 123.7, 120.3, 117.2, 116.9, 115.3 ppm. HRMS (ESI): m/z calculated for + C13H10N4O5: 302.2400、found: 301.0000.

2.1.6. 4-（2、4-ジニトロフェニルヒドラゾノ）メチル）ベンゼン-1、3-ジオール

2、4-ジニトロフェニルヒドラジン（0.69g、3.48mmol、1eq）の存在下に、2、4-ジヒドロキシベンズアルデヒド（0.50g、1.04eq, 3.62 mmol）から粗生成物を得、これを熱エタノールからの再結晶により精製し、生成物 (0.66 g, 2.07 mmol, 60%) を暗赤色の固体として得た。 (ペットエーテル 70％：EtOAc 30％）：0.51。 Mpt: 270-274°C; UV-Vis (MeOH) : 403 nm. 赤外線（neat）υmax（cm-1）：3364（OH）、3094（C = CH）、1612、1584（ArC = C） 592（ArH）。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 11.58 (1H, H-C3′, s, ArOH), 10.11 (1H, H-C1, s, NH), 9.94 (1H, H-C5′, s, ArOH), 8.87 (1H, H-C3, s, ArH), 8.86 (1H, s, N= CH), 8.86 (1H, n= CH).33 (1H, H-C4′, s, ArH), 8.36 (1H, H-C5, d, J = 12.0, ArH), 7.95-7.97 (1H, H-C6, d, J = 8.0, ArH), 7.54 (1H, H-C7, m, ArH), 6.38 (1H, H-C6′, d, J = 8.0, ArH) ppm.となった。 13C NMR (400 MHz, DMSO-d6) 161.8, 159.1, 148.2, 144.6, 136.7, 130.1, 129.3, 128.8, 123.6, 116.9, 112.0, 108.7, 102.1 ppm

2.2. 化合物の抗菌性評価

2.2.1. 試験菌の入手先

Staphylococcus aureus (SA) (ATCC 25923), Escherichia coli (EC) (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (PA) (ATCC 27853) の純粋培養物をKwame Nkrumah University of Science and Technology (KNUST), Kumasi, Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciencesの薬剤部微生物課から入手した。 ただし，Klebsiella pneumoniae（KP），Candida albicans（CA），Streptococcus pneumoniae（SP）はKomfo Anokye Teaching Hospital, Kumasiから入手した臨床株で，KNUSTの薬剤学教室で培養された． 最小発育阻止濃度（MIC）の測定

ヒドラゾン誘導体と参考薬剤であるciprofloxacinおよびfluconazoleの最小発育阻止濃度（MIC）の測定には微量液体希釈法を採用した。 96ウェルマイクロタイタープレートに125 μLの倍力栄養ブロスを充填し，異なる濃度のヒドラゾン誘導体を添加した。 の範囲の参照薬剤を12.5 µL/mL～40 µL/mLを同様に処理した。 各ウェルに1×105 cfu/mLの試験菌のアリコートを添加した。 コントロールプレートには、栄養ブロスと試験菌のみを添加した。 37℃で培養し（細菌は24時間，真菌は48時間），その後，1.25 mg/mlの3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2, 5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）20μLをそれぞれのウェルに導入した． 20分後、成長を示す紫色に着色しているかどうかを観察した。 20分後に発色していることを確認し，発色していないヒドラゾン誘導体および参考薬剤の最小濃度をMIC値とした． なお，測定は反復して行った． 耐性調節試験

耐性調節試験は、96ウェルプレートに125μLの倍力栄養ブロスを充填し、同量の40μLのフェニルヒドラゾンを添加した。 シプロフロキサシンは50 µL/ml～7.812 µL/ml，フルコナゾールは15.625 µL/ml～7.812 µL/mlの範囲で異なる濃度で添加した。 各ウェルに試験菌1×105 cfuを含む25 μLを加え，37℃で培養した（細菌は24時間，真菌は48時間）後，各ウェルにMTTを20 μL添加した． 測定は反復して行った。 結果と考察

3.1. Phenylhydrazonesの構造解析

化合物の合成に採用した合成経路は、ビルディングブロックの市販品を考慮し、アルデヒドまたはケトンとヒドラジンの間の標準縮合反応に従いました（Scheme 1）。 逆合成切断法により、目的の化合物を合成するための重要な中間体として、さまざまなアルデヒドとケトンを同定することができました。 このプロセスでは、酸性化した溶液中で2, 4-ジニトロフェニルヒドラジンをカルボニルに求核攻撃することにより、律速された芳香族が得られる。 この後、反応性中間体を脱水して最終生成物の2, 4-ジニトロフェニルヒドラゾン誘導体を得た。

合成手順のデータは実験セクションに含まれ、順序に従って解釈する：融点範囲（Mpt.)を摂氏(℃)で、紫外可視スペクトルからの最大吸収の波長、赤外スペクトル、1H NMR 、13C NMR、およびSA5 (化合物5)（最も活性な化合物の1つ）の確認手段としてのHRMS。

3.1.1. UV-Vis Spectroscopy

補足のBP1の確認ツールとして6化合物すべてについてメタノールをブランクとして紫外、可視波長（200-800nm）のスペクトルを測定しました。 合成したフェニルヒドラゾンの電子スペクトルから得られた203 nmと403 nmの吸収帯は、フェニルヒドラゾン上の様々な置換基の助色素によって寄与される遷移とみなすことができる。 例えば、化合物BP1をメタノールに溶解し、紫外可視領域でスキャンすると、203 nm、314 nm、382 nmに吸収を示し、これはベンゾフェノンと2，4-ジニトロフェニルヒドラジンのカップリング後にフェニルヒドラゾンが広範囲に共役したことに起因していると思われる。 しかし，化合物 BP1 は 382 nm に最大吸収を示し，これは共役の増加に起因すると考えられる。 また、化合物BA2、MHB3、VL4、SA5、DHB6は、それぞれ378 nm、392 nm、394 nm、386 nm、403 nmに最大吸収を示し、サポート情報において観察されたとおりであった。

広範囲の共役は、BP1（2つの芳香環発色団）、MHB3（メタヒドロキシ助色団）、VL4（ヒドロキシおよびメトキシ助色団）、SA5（オルトヒドロキシ助色団）およびDHB6（ヒドロキシ助色団）を含むフェニルヒドラゾンの発色団の存在によるものと考えることができる。 このことから、助色団と余分な発色団を持つヒドラゾンは共役を拡大し、右にシフトする（バスクロミックシフト）ことが示唆された。 赤外分光法

赤外スペクトルは化合物の官能基を知ることができます。 試料としての化合物5の赤外スペクトルから、約3300cm-1から伸びる広いバンドと約3000cm-1の脂肪族CH領域への傾斜の存在は、ヒドロキシ官能基の存在を示し、この場合、添付文書に観察されるようにフェノールのものである。

また、IRスペクトル（補足情報）から、MHB3、VL4、SA5、DHB6などの化合物は、表1に示すように、ヒドロキシ基を持たないBP1およびBA2と比較して、1138〜1620cm-1の領域にC = Cストレッチバンドの鋭い強いピークを示すことが確認された。 ヒドラジンとカルボニルとの縮合反応で生成するC = Nの存在は，置換基の付加によって1138-1640 cm-1に振動するベンゼン中の芳香族sp2混成炭素（C = C）と重なっていることが分かった。 C = N の振動周波数は 1580-1600 cm-1 の範囲にあるため、実験データに示されるように、芳香族 C = C の対応するバンドが存在すると、それらのバンドは明確に区別することができない。

3.1.3. 核磁気共鳴（NMR）分光法

NMR の測定は、1 次元（1D）NMR 技術（1H および 13C）および 2 次元 NMR 技術、DEPT-Q（四級炭素に対する偏光移動による歪みなし増強）により合成したすべての 6 つのフェニルヒドラゾンについて実施されました。 これらのデータは、実験の項で各化合物に割り当てられている。 化合物 BP1，BA2，MHB3，VL4，SA5，DHB6 について，それぞれ 1H NMR，13C NMR，DEPT-Q スペクトルデータにより構造を確認した． DHB6（化合物6）については、（図2、表1）、プロトンNMR（補足情報）から、はるか下方に共鳴を示す化学シフトは、一重項シグナルを持つヒドロキシプロトンの存在を意味することが分かりました。 このプロトンは、電気陰性酸素の脱シールド効果が高いため、第二級アミンプロトンよりもさらに下の領域に共鳴している。 この化学シフトは水酸基の化学シフト (9.94 ppm) よりもわずかに高く、これは前者がイミン結合中の電気陰性窒素原子の化学環境に近いためである。 したがって、11.54 ppmの最初の水酸基の一重項シグナルの後に、他の水酸基のシグナルの前に窒素原子の電気陰性度のために10.11の一重項シグナル二次アミノプロトンが続く。 電気陰性度の高い2つのニトロ基に挟まれた芳香族プロトンが次のシグナルとして8.86 ppmで下界に共鳴していた。 続いて、3級アミノ基に近いプロトンが8.86ppmに共鳴した。 イミンプロトンに結合した3級アミノ基が脱シールドを起こし、8.86ppmのイミンプロトンが一重項シグナルで下界に共鳴した。 次にパラ位のニトロ基に最も近いローンプロトンが7.95-7.97ppmに二重項ピークを持つシグナルとなった。 電気陰性度の低い第二級アミノ基に最も近いもう一つの孤立プロトンも7.64-7.66 ppmに二重項シグナルを与えた。 他の2つの孤立プロトン（1つはジオールの間に、もう1つはイミン結合に直交する）は7.52-7.54ppmに多重項シグナルを与え、パラヒドロキシ基に最も近く、イミン基から炭素結合2つ離れたプロトンは6に二重項シグナルを与えた。38ppm。

DEPT-Q は第一、第二、第三および第四の炭素の区別のために使用されています。 DEPT-Qでは、メチル(CH3)とメチン(CH)のシグナルは正相で上に現れ、メチレン(CH2)と4級炭素のシグナルは負相で下に現れる。 DHB6のDEPT-Qスペクトル（補足情報）では、芳香族メチン炭素と148.2、130.1、102.9に発生する7つの四級炭素を確認し、この場合6つのメチン炭素のみを表す上向き炭素シグナルが161.8, 159.1, 148.2, 136.7, 130.1, 112.0 で存在していることが明らかになりました。 その他の化合物のDEPT-Qは、補足情報にあります。

3.1.4. 質量分析

質量分析は、正確な分子量の決定やイオン化技術を用いた化合物のフラグメンテーションに使用されます。 化合物SA5 phenylhydrazoneは、抗菌評価後、最も活性の高い化合物の一つであった。 エレクトロスプレーイオン化（ESI）質量スペクトルから、ネガティブモードでの分子イオンピークは301.0000（M-H+）であり、理論質量302.2400から0.24（0.41%）の許容範囲を持つ実際の質量であることが分かりました。 このことから、化合物SA5の分子量が確認された。

この質量分析法は、最も活性の高い1つの化合物の分子量を確認するために用いたため、他の化合物には適用しなかった。

4 抗菌評価

4.1. 最小発育阻止濃度（MIC）

最小発育阻止濃度（MIC）は、24時間（細菌）および48時間（真菌）培養した後、病原体の目に見える成長を阻害する抗菌剤の最小濃度である。 フェニルヒドラゾンと2種類の標準的な抗生物質（ciprofloxacinとfluconazole）のMICは，6種類の病原微生物パネルに対して微量液体希釈試験で評価された． その結果，表2に示すように，すべての化合物が試験濃度において弱い抗菌活性を示した． BP1は6つの化合物の中で最も高い抗菌活性を示した。 BA2はMICが699μMと最も低い抗菌活性であった。 MHB3はC. albicansに対して562 μMのMICを示し，それ以外の菌に対しては662 μM以上のMICを示した． VL4は，S. pneumoniae（MIC = 300 µM）を除くすべての試験生物に対して602 µMのMICを記録した。 SA5はS. pneumoniaeとK. pneumoniaeに対するMICはそれぞれ165 μMと331 μMであったが，S. aureus，E. coli，P. aeruginosa，C. albicansに対しては662 μMと高いMICを有していた． DHB6は，S. pneumoniae，K. pneumoniae，C. albicansに対してMIC 314 μMの活性を示したが，S. aureus，E. coli，P. aeruginosaに対しては628 μM以上のMICを有していた． 基準抗菌薬はciprofloxacinを用い，P.aeruginosa，S. pneumoniae，K. pneumoniaeに対するMICは2.36 µM，S. aureusとE. coliに対しては4.72 µMが記録されている． 基準抗真菌薬はフルコナゾールを使用し，得られたMICはC. albicansに対して327 µMであった。 2つのグラム陰性菌に対するフェニルヒドラゾンのMICは552 µMから699 µMの範囲であり，標準のシプロフロキサシンはそれぞれ4.72 µMと2.36 µMでした（表2）。

4.2. Resistant Modulation Activity

既知の耐性菌に対するいくつかの市販抗生物質の活性を改善するsub-MICのフェニルヒドラゾンの傾向を耐性調節試験により検討した。 表2および表3より、S. pneumoniaeに対するsub-MICが50μMのBP1（化合物1）はciprofloxacinのMICを2.36から1へ低下させることができた。078μMとなり、CiprofloxacinのMICを54.32%減少させた。 BP1は、サブMIC50μMのciprofloxacinのK. pneumoniaeに対する性能も改善し、2.36μMから1.078μMにMICを54.32%減少させた。 BP1は、C. albicansに対するフルコナゾール活性を327μMから2.156μMに調整し、フルコナゾールのMICを99.34%減少させた。 同様に、BA2はciprofloxacinのS. pneumoniaeに対する活性を向上させ、ciprofloxacinのMICを2.36から1.36μMに42.37%減少させることができた。 さらに、BA2はC. albicansに対してサブMICである50μMのフルコナゾールの活性を調節し、そのMICを327から1.23μMに減少させ、これはMICの減少が99.6%であることを示している。

MHB3 は S. pneumoniae と Klebsiella pneumoniae に対してシプロフロキサシンの活性を調節し、抗生物質の MIC を 2.36 から 1.29 μM に低下させました。 このMICの減少は、45.33%の減少を示した。 また、MHB3はCandida albicansに対してサブMICである50μMでフルコナゾールの活性を調節し、MICを327μMから5.109に低下させ、最大98.43%低下させたことが確認された。 VL4はciprofloxacinのS. pneumoniaeおよびK. pneumoniaeに対するサブMIC 50 µMでの活性を向上させた。 両者ともMICは2.36μMから1.176μMに低下した。 このMICの減少は、50.17%の減少を表している。 VL4はC. albicansに対してsub-MIC 50μMで再びfluconazoleの性能を調節し、MICを327μMから1.176μMに低下させ、最大99.64%の低下を示した

さらに、化合物5（SA5）はS. pneumoniaeおよびK. pneumoniaeに対してsub-MIC 50μMでciprofloxacinの性能を調節した。 MICはいずれも2.36 µMから1.29 µMに低下し，45.34%減少した。 SA5はC. albicansに対して50 μMのサブMICで再びフルコナゾールの性能を調節し，そのMICを327から1.29 μMに抑制し，99.61%という良好な減少を示した。 DHB6（化合物6）は、sub-MIC 50 µMのciprofloxacinのS. pneumoniaeとK. pneumoniaeに対する活性も調節し、そのMICを2.36から1.23 µMに低下させた（MICが47.88%低下したことを意味する）。 DHB6はC. albicansに対して50μMのサブMICでフルコナゾールの活性を調節し、MICを327μMから1.23μMに低下させ、MICを99.62%低下させた。 SA5とBP1は，ciprofloxacin（P.aeruginosaに対するMICは2.58 µM）と共に耐性調節活性において他の4種のフェニルヒドラゾンより優れており，BP1（17.2 µM）がそれに続いた． したがって，グラム陰性緑膿菌および大腸菌に対するciprofloxacinとの併用による耐性調節活性には，SA5のortho水酸基と芳香族ケトン基の存在が必須であると考えられる。 さらに，メタヒドロキシ基（MHB3），ヒドロキシおよびメトキシ（VL4）の存在，BA2のベンズアルデヒド部分に置換基がないことも活性を向上させており，今後の創薬に向けた検討材料となり得る。 重篤な感染症を引き起こすもう一方のグラム陰性菌であるK. pneumoniaeは，138から699 μMでフェニルヒドラゾンに感受性が高くなった。 また，Phenylhydrazone類とciprofloxacinを亜抑制濃度で併用することにより，K. pneumoniaeの耐性障壁が低下し，MICは5.46μMから1.078とP. pneumoniaeよりもはるかに低くなる傾向が見られた． また、フェニルヒドラゾンはグラム陽性菌に対して87.3～699μMの範囲で同様の活性を示し、黄色ブドウ球菌と肺炎球菌の耐性特性も明らかになった

5. 結論

6つの新規フェニルヒドラゾンのライブラリーの合成と特徴づけに成功した。 1-(2, 4-ジニトロフェニル)-2-(ジフェニルメチレン)ヒドラジン , 1-benzylidene-2-(2, 4-ジニトロフェニル)ヒドラジン , 3-(2-2-(4-dinitrophenyl) hydrazono) methylphenol, 4-(2-(2, 4-ジニトロフェニル）ヒドラゾノ）メチル）-2-メトキシフェノール 、（Z）-2-（2、4-ジニトロフェニル）ヒドラゾノ）メチルフェノール 、4-（2、4-ジニトロフェニルヒドラゾノ）メチル）ベンゼン-1、3-ジオールが挙げられる。

今後の薬物設計や最適化の一環として、フェニルヒドラゾンはその合成可能性と収率の良さから、構造的なバックボーンとして考慮される可能性があります。 この化合物は弱い抗菌性を示すが、標準薬との組み合わせで強い耐性調節作用を示した。 標準薬の活性はMIC値を良好に低下させ、著しく改善された。

略語

NTC:NTC:NTC.T.C:

MIC:

MRSA：Methicillin resistant Staphylococcus aureus
ATCC:	アメリカンタイプカルチャーコレクション
NTCC:	ナショナルタイプカルチャーコレクション
MTT.A.T.C.C.、
(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-Diphenyltetrazolium bromide
MIC:	Minimum inhibitory concentration
TLC.TLC:	Minimum inhibitory concentration
Thin layer chromatography
Cfu:	Colony forming units
Eq.:	Equivalent
DEPT-Q:	Distortionless enhancement of polarization transfer for quaternary carbons
HRSMS:	高分解能マススペクトルを実現しました。

データ利用

研究のデータは、Kwame Nkrumah University of Science and Technology, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmaceutical Chemistryのアーカイブにあります。

利益相反

著者はこの論文の出版に関していかなる利益相反も宣言しません

著者貢献

A.A.A., A.B.、I.A.、Y.D.B.、C.D.K.A.、B.K.H.は研究作業の考案と原稿作成にあたった。 C.D.K.A.、A.B.、A.A.は化合物の合成を設計し、実施した。 C.D.K.A., A.A., I.A.は、概念的な枠組みを構築し、原稿を作成した。 C.D.K.A.とB.K.H.はスペクトル結果を解釈し、構造解析を行った。 2090>

Acknowledgement

The authors are very grateful to all the staff and technicians of Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmacy, KNUST, Kumasi, Ghana, support.Thanks for the support.Y.D.B. and A. in vitro antimicrobial assay and its experimental data and interpretation of the results.Y.D.B., A.A., in vitro antimicrobial assay and providing the data. 2090>

補足資料

補足ファイルには、すべてのスペクトルが含まれています。 (補足資料)