Micronucleo
MN hanno origine da frammenti cromosomici o cromosomi interi che rimangono indietro in anafase durante la divisione nucleare e non sono inclusi nei nuclei principali.13,18,19 I MN sono piccoli corpi extranucleari che nascono nelle cellule in divisione da frammenti acentrici di cromosomi/cromatidi o cromosomi/cromatidi interi che rimangono indietro in anafase e non sono inclusi nei nuclei figli in telofase.20 Alla telofase, si forma un involucro nucleare intorno ai cromosomi e ai frammenti in ritardo, che poi si srotolano e assumono gradualmente la morfologia di un nucleo in interfase, tranne che sono più piccoli dei nuclei principali della cellula (da qui, il termine “micronucleo”).19 I MN che ospitano frammenti cromosomici possono derivare dalla rottura diretta del doppio filamento del DNA, dalla conversione delle rotture del singolo filamento in rotture del doppio filamento dopo la replicazione cellulare, o dall’inibizione della sintesi del DNA.20
MN può formarsi attraverso diverse vie: in particolare, da frammenti cromosomici o cromatidi acentrici. Una piccola percentuale di frammenti cromosomici acentrici può semplicemente derivare da rotture non riparate del DNA a doppio filamento. Altri meccanismi che potrebbero portare alla formazione di MN da frammenti acentrici includono la riparazione per escissione simultanea di basi danneggiate (ad esempio, 8-oxo-deoxyguanosina) o inappropriate incorporate nel DNA (ad esempio, uracile) che sono in prossimità e su filamenti di DNA complementari opposti.21 Un altro meccanismo che può portare alla MN da eventi di perdita del cromosoma è l’ipometilazione della citosina nelle sequenze ripetute centromeriche e pericentromeriche, come le classiche ripetizioni satelliti nelle regioni pericentromeriche e le ripetizioni di ordine superiore del DNA satellite nel DNA centromerico.21 A causa del ruolo centrale delle proteine del cinetocoro nell’agganciare i cromosomi al fuso, è probabile che le mutazioni che portano a difetti nella dinamica di interazione tra cinetocoro e microtubuli possano causare la formazione di MN a causa della perdita del cromosoma all’anafase. Altre variabili che possono aumentare la MN da perdita di cromosomi sono difetti nell’assemblaggio del fuso mitotico, difetti del check point della mitosi e un’anomala amplificazione del centrosoma.21
Il destino della MN dopo la sua formazione nella cellula micronucleata è poco conosciuto. Il loro destino postmitotico include: (1) l’eliminazione della cellula micronucleata come conseguenza dell’apoptosi; (2) l’espulsione dalla cellula (quando il DNA all’interno del MN non dovrebbe essere funzionale o capace di replicarsi a causa dell’assenza dei necessari componenti citoplasmatici); (3) reincorporazione nel nucleo principale (quando il cromosoma reincorporato può essere indistinguibile da quello del nucleo principale e potrebbe riprendere la normale attività biologica); e (4) ritenzione nel citoplasma della cellula come entità extranucleare (quando il MN può completare uno o più cicli di replicazione del DNA/cromosoma).20,22
Il vantaggio chiave del test CBMN sta nella sua capacità di rilevare sia eventi clastogenici che aneugenici, che portano ad aberrazioni cromosomiche strutturali e numeriche, rispettivamente.20 I clastogeni inducono la MN rompendo la doppia elica del DNA, formando frammenti acentrici che sono incapaci di aderire alle fibre del fuso e di integrarsi nei nuclei figli, e quindi vengono abbandonati durante la mitosi. Lo stesso accade ai cromosomi interi con cinetocori danneggiati; non possono attaccarsi ai microtubuli che tirano i cromatidi verso le cellule figlie durante la mitosi e quindi rimangono fuori dai nuovi nuclei. Questo danno potrebbe essere generato da sostanze chimiche che reagiscono con le proteine che formano i cinetocori.23,24
Gli antagonisti sono sostanze chimiche che impediscono la formazione dell’apparato del fuso durante la mitosi. Questi agenti generano non solo cromatidi interi che rimangono fuori dai nuclei, formando così MN, ma anche la formazione di cellule multinucleate, in cui ogni nucleo conterrebbe un numero diverso di cromosomi. Questi agenti sono anche in grado di indurre un aumento delle figure mitotiche che si vedono chiaramente negli stessi vetrini. Con il test CBMN è possibile distinguere tra MN originati da cromosomi interi e quelli originati da frammenti acentrici, così come determinare se la malsegregazione dei cromosomi si sta verificando tra i nuclei in una cellula binucleata che potrebbe non contenere MN, utilizzando sonde centromeriche.8,10,19
Sonde di DNA pancentromeriche sono utilizzate per distinguere tra MN originati da qualsiasi evento di perdita di cromosomi interi e MN contenenti frammenti di cromosomi acentrici. L’uso di sonde di DNA centromerico specifiche per il cromosoma permette sia la determinazione di specifici eventi di perdita cromosomica con conseguente MN che la segregazione ineguale di specifici cromosomi tra i nuclei figli anche in assenza di formazione di MN.21 Le sonde pancentromeriche dovrebbero essere usate solo per distinguere tra MN originata da rotture cromosomiche (negativo al centromero) e perdita cromosomica (positivo al centromero). Le sonde centromeriche specifiche per i cromosomi dovrebbero essere usate solo per misurare la malsegregazione (dovuta a non disgiunzione o perdita cromosomica) che coinvolge cromosomi unici.8,10,19,21,25 La valutazione dell’origine meccanica delle singole MN attraverso l’identificazione del centromero e del cinetocoro contribuisce all’alta sensibilità e specificità del metodo.20
Importanti fattori influenzano la frequenza basale delle MN nei linfociti umani. L’età e il sesso sono le variabili demografiche più importanti che influenzano l’indice MN; le frequenze nelle femmine sono maggiori di quelle dei maschi di un fattore di 1,2-1,6, a seconda del gruppo di età.26 La frequenza MN è stata significativamente e positivamente correlata all’età nei maschi e nelle femmine ed è influenzata da fattori dietetici come la carenza di folati e i livelli plasmatici di vitamina B12 e omocisteina. È stato anche proposto che l’indice di MN possa essere influenzato dalla propensione delle cellule di un individuo a subire l’apoptosi e da fattori genetici come i polimorfismi genetici.10,20,27
In forma generale, la formazione di MN è attribuita a una varietà di insulti al materiale genetico, che potrebbero essere classificati come fattori esogeni ed endogeni. I fattori esogeni includono radiazioni, agenti chimici e invasione di microrganismi. I fattori endogeni includono difetti genetici, cambiamenti patologici, carenza di ingredienti nutrizionali essenziali (per esempio, acido folico) e lesioni indotte da prodotti metabolici deleteri (come le specie reattive dell’ossigeno).28
L’ipotesi di un’associazione predittiva tra la frequenza di MN nel test CBMN nei linfociti e lo sviluppo del cancro è supportata da una serie di risultati: (1) un’associazione tra la frequenza di MN e il rischio di cancro è stata dedotta dalle somiglianze meccanicistiche con le aberrazioni cromosomiche, che hanno dimostrato di essere predittive per il cancro; (2) in vitro, si osserva un’elevata concordanza tra le aberrazioni cromosomiche e MN; (3) un aumento della frequenza di MN è osservato nei linfociti di pazienti affetti da cancro e in pazienti con sindromi che li rendono inclini al cancro, come la sindrome di Bloom e la telangiectasia ataxica; (4) la frequenza di MN è significativamente associata alla concentrazione ematica di vitamine come il folato, le cui carenze sono associate ad un aumento del rischio di alcuni tumori; (5) esiste un legame diretto tra le frequenze di MN e le fasi iniziali della carcinogenesi: cioè un’associazione significativa tra l’aumento delle frequenze di MN e le categorie diagnostiche di basso e alto grado della carcinogenesi cervicale nelle donne.20
La formazione di anomalie nucleari come i MN, i riarrangiamenti cromosomici e i ponti di anafase (che portano a cicli di rottura-fusione-ponte e alla generazione di più MN) sono eventi comunemente visti nelle prime fasi della carcinogenesi. Livelli elevati di MN indicano difetti nella riparazione del DNA e nella segregazione cromosomica che potrebbero portare alla generazione di cellule figlie con un dosaggio genico alterato, o alla deregolazione dell’espressione genica che potrebbe portare all’evoluzione del fenotipo di instabilità cromosomica spesso visto nel cancro. Queste considerazioni danno supporto meccanicistico ad una possibile associazione causale tra la frequenza di MN e il rischio di cancro. Uno studio di Bonassi et al.29 ha osservato un’associazione tra la frequenza di MN e il rischio di cancro nei tumori maligni non ematologici, il che suggerisce che gli eventi di danno al genoma nei linfociti possono essere correlati con gli eventi che danno inizio al cancro in altri tessuti attraverso un fattore genetico, alimentare o ambientale comune.