Mikrokerne
MN entstehen aus Chromosomenfragmenten oder ganzen Chromosomen, die bei der Kernteilung hinter der Anaphase zurückbleiben und nicht in die Hauptkerne aufgenommen werden.13,18,19 MN sind kleine außerkernige Körper, die in sich teilenden Zellen aus azentrischen Chromosomen-/Chromatidfragmenten oder ganzen Chromosomen/Chromatiden entstehen, die in der Anaphase zurückbleiben und in der Telophase nicht in die Tochterkerne eingeschlossen werden.20 In der Telophase bildet sich eine Kernhülle um die zurückgebliebenen Chromosomen und Fragmente, die sich dann abwickeln und allmählich die Morphologie eines Interphasenkerns annehmen, mit der Ausnahme, dass sie kleiner sind als die Hauptkerne in der Zelle (daher der Begriff „Mikronukleus“).19 MN, die Chromosomenfragmente beherbergen, können durch direkten Doppelstrang-DNA-Bruch, durch Umwandlung von Einzelstrangbrüchen in Doppelstrangbrüche nach der Zellreplikation oder durch Hemmung der DNA-Synthese entstehen.20
MN können auf verschiedenen Wegen gebildet werden: nämlich aus azentrischen Chromosomen- oder Chromatidfragmenten. Ein kleiner Teil der azentrischen Chromosomenfragmente kann einfach aus nicht reparierten doppelsträngigen DNA-Brüchen entstehen. Andere Mechanismen, die zur Bildung von MN aus azentrischen Fragmenten führen können, umfassen die gleichzeitige Exzisionsreparatur von geschädigten (z. B. 8-Oxo-Desoxyguanosin) oder ungeeigneten Basen, die in die DNA eingebaut sind (z. B. Uracil) und sich in der Nähe von und auf gegenüberliegenden komplementären DNA-Strängen befinden.21 Ein weiterer Mechanismus, der zu MN aufgrund von Chromosomenverlusten führen kann, ist die Hypomethylierung von Cytosin in zentromerischen und perizentromerischen Wiederholungssequenzen, wie z. B. klassische Satellitenwiederholungen in perizentromerischen Regionen und Satelliten-DNA-Wiederholungen höherer Ordnung in der zentromerischen DNA.21 Aufgrund der zentralen Rolle von Kinetochor-Proteinen bei der Verbindung von Chromosomen mit der Spindel ist es wahrscheinlich, dass Mutationen, die zu Defekten in der Kinetochor- und Mikrotubuli-Zusammenwirkungsdynamik führen, die Bildung von MN aufgrund von Chromosomenverlusten in der Anaphase verursachen könnten. Andere Variablen, die die Bildung von MN aufgrund von Chromosomenverlusten wahrscheinlich verstärken, sind Defekte beim Aufbau der mitotischen Spindel, Defekte an den Mitose-Kontrollpunkten und eine abnormale Zentrosomen-Amplifikation.21
Das Schicksal der MN nach ihrer Bildung in der mikrokernhaltigen Zelle ist nur unzureichend bekannt. Ihr postmitotisches Schicksal umfasst: (1) Eliminierung der mikrokernhaltigen Zelle als Folge der Apoptose; (2) Ausstoß aus der Zelle (wenn die DNA innerhalb der MN aufgrund des Fehlens der notwendigen zytoplasmatischen Komponenten voraussichtlich nicht funktionsfähig oder replikationsfähig ist); (3) Wiedereinbau in den Hauptkern (wenn das wiedereingebaute Chromosom nicht von dem des Hauptkerns zu unterscheiden ist und seine normale biologische Aktivität wieder aufnehmen könnte); und (4) Verbleib im Zytoplasma der Zelle als extranukleare Einheit (wenn die MN eine oder mehrere Runden der DNA/Chromosomenreplikation abschließen kann).20,22
Der Hauptvorteil des CBMN-Tests liegt in seiner Fähigkeit, sowohl klastogene als auch aneugene Ereignisse zu erkennen, die zu strukturellen bzw. numerischen Chromosomenaberrationen führen.20 Klastogene induzieren MN, indem sie die DNA-Doppelhelix brechen und azentrische Fragmente bilden, die nicht in der Lage sind, an den Spindelfasern zu haften und sich in die Tochterkerne zu integrieren, so dass sie während der Mitose ausgesondert werden. Das Gleiche gilt für ganze Chromosomen mit beschädigten Kinetochoren; sie können sich nicht an den Mikrotubuli festhalten, die die Chromatiden während der Mitose zu den Tochterzellen ziehen, und bleiben daher außerhalb der neuen Kerne. Diese Schäden könnten durch Chemikalien verursacht werden, die mit Proteinen reagieren, die die Kinetochoren bilden.23,24
Aneugene sind Chemikalien, die die Bildung des Spindelapparats während der Mitose verhindern. Diese Mittel führen nicht nur dazu, dass ganze Chromatiden aus den Kernen entfernt werden und sich so MN bilden, sondern auch zur Bildung von Zellen mit mehreren Kernen, in denen jeder Kern eine andere Anzahl von Chromosomen enthält. Diese Agenzien führen wahrscheinlich auch zu einer Zunahme der Mitosezahlen, die auf denselben Objektträgern deutlich zu sehen sind. Mit dem CBMN-Assay ist es möglich, zwischen MN, die von ganzen Chromosomen stammen, und solchen, die von azentrischen Fragmenten stammen, zu unterscheiden sowie festzustellen, ob in einer zweikernigen Zelle, die möglicherweise keine MN enthält, eine Chromosomenfehlverteilung zwischen den Kernen stattfindet, indem zentromerische Sonden verwendet werden.8,10,19
Pancentromerische DNA-Sonden werden verwendet, um zwischen MN, die von einem Verlust ganzer Chromosomen stammen, und MN, die azentrische Chromosomenfragmente enthalten, zu unterscheiden. Die Verwendung chromosomenspezifischer zentromerischer DNA-Sonden ermöglicht sowohl die Bestimmung spezifischer Chromosomenverluste, die zu MN führen, als auch die ungleiche Segregation spezifischer Chromosomen unter den Tochterkernen, selbst wenn keine MN gebildet werden.21 Pancentromerische Sonden sollten nur verwendet werden, um zwischen MN zu unterscheiden, die durch Chromosomenbrüche (zentromer-negativ) und Chromosomenverlust (zentromer-positiv) entstehen. Chromosomen-spezifische Zentromer-Sonden sollten nur verwendet werden, um Fehlseigerungen (aufgrund von Nicht-Disjunktion oder Chromosomenverlust) zu messen, die einzelne Chromosomen betreffen.8,10,19,21,25 Die Bewertung des mechanistischen Ursprungs einzelner MN durch Zentromer- und Kinetochor-Identifizierung trägt zur hohen Sensitivität und Spezifität der Methode bei.20
Wichtige Faktoren beeinflussen die MN-Häufigkeit in menschlichen Lymphozyten im Ausgangszustand. Alter und Geschlecht sind die wichtigsten demografischen Variablen, die sich auf den MN-Index auswirken; die Häufigkeit bei Frauen ist je nach Altersgruppe um den Faktor 1,2-1,6 höher als bei Männern.26 Die MN-Häufigkeit war bei Männern und Frauen signifikant und positiv mit dem Alter korreliert und wird durch Ernährungsfaktoren wie Folatmangel und Plasmaspiegel von Vitamin B12 und Homocystein beeinflusst. Es wurde auch vorgeschlagen, dass der MN-Index durch die Neigung der Zellen eines Individuums, sich der Apoptose zu unterziehen, und durch genetische Faktoren wie genetische Polymorphismen beeinflusst werden kann.10,20,27
Im Allgemeinen wird die Bildung von MN auf eine Vielzahl von Beeinträchtigungen des genetischen Materials zurückgeführt, die als exogene und endogene Faktoren klassifiziert werden können. Zu den exogenen Faktoren gehören Strahlung, chemische Stoffe und das Eindringen von Mikroorganismen. Zu den endogenen Faktoren gehören genetische Defekte, pathologische Veränderungen, Mangel an essentiellen Nahrungsbestandteilen (z. B. Folsäure) und Verletzungen durch schädliche Stoffwechselprodukte (wie reaktive Sauerstoffspezies).28
Die Hypothese eines prädiktiven Zusammenhangs zwischen der Häufigkeit von MN im CBMN-Test in Lymphozyten und der Krebsentwicklung wird durch eine Reihe von Erkenntnissen unterstützt: (1) Ein Zusammenhang zwischen der Häufigkeit von MN und dem Krebsrisiko wurde aus mechanistischen Ähnlichkeiten mit Chromosomenaberrationen abgeleitet, die sich als prädiktiv für Krebs erwiesen haben; (2) in vitro wird eine hohe Übereinstimmung zwischen Chromosomenaberrationen und MN beobachtet; (3) ein Anstieg der MN-Häufigkeit wird in Lymphozyten von Krebspatienten und bei Patienten mit Syndromen beobachtet, die sie krebsanfällig machen, wie das Bloom-Syndrom und Ataxia telangiectasia; (4) die Häufigkeit von MN steht in signifikantem Zusammenhang mit der Konzentration von Vitaminen wie Folsäure im Blut, deren Mangel mit einem erhöhten Risiko für bestimmte Krebsarten in Verbindung gebracht wird; (5) es besteht ein direkter Zusammenhang zwischen der Häufigkeit von MN und frühen Stadien der Krebsentstehung: Nämlich ein signifikanter Zusammenhang zwischen erhöhten MN-Häufigkeiten und niedriggradigen und hochgradigen diagnostischen Kategorien der Zervixkarzinogenese bei Frauen.20
Die Bildung von Kernanomalien wie MN, chromosomale Umlagerungen und Anaphase-Brücken (die zu Bruch-Fusions-Brücken-Zyklen und zur Bildung weiterer MN führen) sind Ereignisse, die häufig in den frühen Stadien der Karzinogenese auftreten. Erhöhte MN-Konzentrationen deuten auf Defekte bei der DNA-Reparatur und der Chromosomensegregation hin, die zur Bildung von Tochterzellen mit veränderter Gendosierung oder zu einer Deregulierung der Genexpression führen könnten, die zur Entwicklung des Phänotyps der Chromosomeninstabilität führen könnte, der häufig bei Krebs auftritt. Diese Überlegungen liefern mechanistische Unterstützung für einen möglichen kausalen Zusammenhang zwischen der Häufigkeit von MN und dem Krebsrisiko. In einer Studie von Bonassi et al.29 wurde ein Zusammenhang zwischen der Häufigkeit von MN und dem Krebsrisiko bei nicht-hämatologischen Malignomen beobachtet, was darauf schließen lässt, dass Genomschäden in Lymphozyten über einen gemeinsamen genetischen, Ernährungs- oder Umweltfaktor mit krebsauslösenden Ereignissen in anderen Geweben korreliert sein könnten.