Forscher können zwischen mehreren LSFM/SPIM-Systemen (Single/Selective Plane Illumination Microscopy) wählen, die sich in bestimmten Aspekten unterscheiden, aber alle die folgenden Hauptmerkmale aufweisen: Im Gegensatz zur konfokalen oder Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie wird nur ein dünner Ausschnitt der Probe durch ein Lichtblatt beleuchtet. Ein weiterer wichtiger Unterschied ist die Trennung der optischen Pfade von Beleuchtung und Detektion. Um die Messung von unscharfer Fluoreszenz zu vermeiden, wird das emittierte Licht auf einer anderen Achse als der Beleuchtungsachse detektiert (z. B. orthogonal). Auf diese Weise wird unnötige unscharfe Fluoreszenz nicht angeregt, was Photobleiche und Photobeschädigung in Bereichen verhindert, die gerade nicht gescannt werden. Schließlich wird bei der LSFM das Bild durch Scannen einer Lichtebene (optischer Schnitt) und nicht Punkt für Punkt erzeugt, was die Scangeschwindigkeit im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie deutlich erhöht.
Diese Vorteile – verringerte zelluläre Belastung, Hintergrundfluoreszenz und Zeitaufwand – sind besonders wichtig bei der 3D-Live-Zell-Bildgebung von empfindlichen biologischen Proben.