7 RAG-bindning Genomewide
Med tanke på RAG1:s direkta DNA-bindningsegenskaper, kombinerat med den unika rikedomen av RSS:er som finns i antigenreceptorgenerna, var det rimligt att anta att V(D)J-rekombinationens platsspecificitet helt enkelt förstärks av RAG1:s rekrytering till de DNA-substrat som föredras. RAG2 bör på grund av sin PHD och sin avsaknad av inneboende katalytisk aktivitet inte uppvisa några funktionella begränsningar av sina lokaliseringsmönster. Följaktligen binder RAG2 brett över lymfocytgenomet och upptar en stor del (~ 60 %) av de aktiva TSS:erna, som är berikade med H3K4me3 (Ji et al., 2010; Teng et al., 2015). RAG1 lokaliseras dock också till tusentals platser (~ 3500 i musens tymocyter och pre-B-celler) som är gemensamt ockuperade av RAG2 och H3K4me3, vilket omfattar en betydande del av mycket aktiva, linjespecifika promotorer och förstärkare (Teng et al., 2015). Denna utbredda lokalisering observeras också för en katalytisk mutant av RAG1 (D708A), vilket tyder på att den utbredda bindningen av RAG1 inte återspeglar postcleavage ackumulering (Teng et al., 2015). RAG1-bindningsställena utanför antigenreceptorgenerna visade ingen tydlig korrelation med närvaron av RSS-liknande motiv (cryptic RSSs, eller cRSSs), vilket ytterligare indikerar att sekvensspecifika kontakter och RAG-medierad klyvningsaktivitet inte kunde förklara mönster av RAG1-bindning i hela genomet. I stället är markörer av kromatintillgänglighet de bästa förutsägarna av RAG1-rekrytering: H3K4me3, H3K27Ac, förhöjt GC-innehåll och förhöjt CpG-innehåll (Teng et al., 2015).
I själva verket är det bara en handfull exempel som visar specifik RAG1-rekrytering till antigenreceptorgener via transfaktorer som interagerar med både RAG1 och specifika DNA-motiv. I varje fall beror rekryteringshändelsens lokusspecificitet inte på RSS i sig, utan på ett bindningsmotiv för en transkriptionsfaktor som av en slump överlappar med en RSS. Musens Tcrb-lokus illustrerar ett exempel där riktad RAG1-rekrytering bidrar till ”bortom 12/23”-restriktioner som hjälper till att upprätthålla den korrekta ordningen för rekombination (Dβ-Jβ före Vβ-DJβ). De 3′ 23-RSS som flankerar Dβ1 och Dβ2 innehåller konserverade bindningsställen för c-fos, en underenhet till transkriptionsfaktorn AP-1 (Wang et al., 2008). På ett sätt som är oberoende av dess transkriptionsaktiverande egenskaper rekryterar c-fos företrädesvis RAG1 till 3′ Dβ-RSS:erna, vilket gynnar Dβ-Jβ-rekombination (Wang et al., 2008). I B-linjen är den analoga antigenreceptorlokusen Igh-genen, där direkt Vh-Dh-rekombination missgynnas i förhållande till Vh-DJh-rekombination. I detta fall tycks dock rekombinationsordningen regleras av lokala förskjutningar i epigenetiska markeringar som följer D-Jh-rekombination och markerar DJ-produkten för föredragen RAG1-bindning och rekombination i förhållande till germina Dh-gen-segment (Subrahmanyam et al., 2012). Dessutom undertrycks direkt Vh-Dh-rekombination av ett sekvenselement som kallas IGCR1 och som ligger mellan D- och V-genklustren (Guo et al., 2011). IGCR1 innehåller två viktiga CTCF-platser och tros fungera som en ankarpunkt för kromatinslingor som avskiljer DJ-delen av Igh-lokusen från V-delen (Guo et al., 2011; Lin, Guo, Su, Zhang, & Alt, 2015; Medvedovic et al., 2013). Det mänskliga Tcrd-lokuset ger ett annat exempel på lokusspecifik RAG1-deposition, där Runx1-beroende RAG1-rekrytering till Dδ2 gynnar en Dδ2-Dδ3-rearrangemangshändelse som föregår klassisk Dδ-Jδ-rekombination (Cieslak et al., 2014). Detta resulterar i människospecifik inkludering av två D-gen-segment i Tcrd-rearrangemang. Slutligen har Pax5 föreslagits interagera med RAG och underlätta RAG-rekrytering till Vh-gen-segment (Zhang et al., 2006), även om det ännu inte har visats att denna mekanism förbättrar den endogena Igh-lokussammansättningen.
Outom dessa undantag tycks RAG1-bindning inte initieras främst från sekvensspecifika rekryteringshändelser. Även inom Tcr- och Ig-generna sträcker sig RAG1-bindningen bortom RSS-gränserna och upptar introniska regioner som är berikade med H3K4me3 men saknar RSS:er (Teng et al., 2015). Detta betyder inte att RSS:erna inte spelar sekundära roller för att stabilisera eller förstärka RAG1-bindningen efter rekryteringen. Tcra- och Igk-generna är de främsta rekryterarna av RAG1-bindning i dubbelpositiva tymocyter respektive pre-B-celler, och definierade toppar av RAG1-ackumulering observeras tydligt över RSS:erna i rekombinationscentra (Teng et al., 2015). Den exceptionella tätheten av RSS:er i antigenreceptorgenerna är sannolikt en av de viktigare egenskaperna som skiljer dem från resten av genomet.
Genomet i allmänhet uppvisar dock RSS-oberoende RAG1-rekrytering, som troligen sker genom ospecifika interaktioner mellan RAG1 och DNA som medieras av olika domäner i RAG1-kärnan, inklusive NBD:n (Teng et al., 2015; Yin et al., 2009). Dessutom kan indirekt rekrytering av RAG1 till kromatin ske genom dess interaktion med RAG2, även om det senare inte helt och hållet kan förklara RAG1-bindningsmönster, som delvis bibehålls i avsaknad av RAG2, om än med minskad intensitet (Teng et al., 2015).
Den genomiska räckvidden av RAG1-bindningsställen, även om den är bredare än vad som förutspåtts, expanderar ytterligare i avsaknad av icke-kärndomäner av antingen RAG1 eller RAG2. I avsaknad av RAG2:s C-terminala region (som inkluderar PHD) diffunderar RAG1 mot platser med lägre tätheter av H3K4me3, snarare än att söka sig till de mest aktiva TSS:erna (Teng et al., 2015). En möjlighet är att detta beror på en avmaskering av ytterligare icke-specifika DNA-bindande aktiviteter hos RAG1, med tanke på frånvaron av den autoinhibitoriska domän som ligger i RAG2:s C-terminala region (Lu et al., 2015). En annan möjlighet är att i avsaknad av RAG2:s PHD-domän har RAG-komplexet mindre benägenhet att hemsöka regioner med hög H3K4me3. Det faktum att deletion av RAG2:s C-terminala region leder till en uppreglering av RAG1:s proteinnivåer kan också vara relevant för det bredare RAG1-bindningsmönstret (Teng et al., 2015). Core RAG1 binder också mycket mer promiskuöst än fullängds-RAG1 och uppvisar intressant nog en förhöjd intensitet i bindningen vid många receptorplatser som inte är antigena, men minskad intensitet vid Tcra-locus, i förhållande till fullängds-RAG1 (Teng et al., 2015). Detta kan återspegla förändringar i de inneboende DNA-bindande egenskaperna hos det trunkerade RAG1-proteinet, eller frånvaron av aktiviteter som kodas i RAG1:s icke-kärnterminaler (t.ex. RING-medierad histon-ubiquitylering eller C-terminal-medierad autoinhibition). Relevant kan också vara det faktum, som nämnts ovan, att core RAG1 uttrycks i betydligt högre nivåer än fullängds RAG1.
RAG-rekombinaset tolererar sekvensvariation inte bara i sina substrat, särskilt i RSS-spacern, utan också i heptameren och nonameren (Hesse et al, 1989; Lewis, Agard, Suh, & Czyzyk, 1997; Marculescu, Le, Simon, Jaeger, & Nadel, 2002; Ramsden, Baetz, & Wu, 1994; Zhang & Swanson, 2008). Även interaktionen mellan RAG1 och nonamer som förmedlas av NBD är beroende av relativt få sekvensspecifika kontakter (Yin et al., 2009). De RSS:er som befolkar antigenreceptorgener är olika i sitt sekvensinnehåll (ibland avviker de avsevärt från konsensus heptamer- och nonamermotiv), och RAG:s substratigenkänning måste vara tillräckligt flexibel för att möjliggöra maximal repertoardiversitet. Utanför antigenreceptorgenerna visar RAG1-bindningsställen ingen kumulativ preferens för någon särskild sekvenssignatur (Teng et al., 2015).
Flexibelt substratigenkänning av RAG skapar dock ett problem för resten av genomet. De ganska minimala sekvenskraven för en funktionell RSS (åtminstone enligt de regler som vi för närvarande förstår) gör det möjligt för cRSS att förekomma ganska ofta i ryggradsdjursgenom (Lewis et al., 1997). Faran med tillfälliga cRSSs blir uppenbar genom deras deltagande i RAG-beroende genetiska omarrangemang som bidrar till lymfomagenesen (Larmonie et al., 2013). Eftersom majoriteten av RAG1-bindningen i hela genomet styrs av ospecifik rekrytering till DNA eller tillgängligt kromatin, verkar det biologiskt klokt att begränsa tillgången till starka cRSSs i närheten av RAG1-bindningsställen och på så sätt minimera potentialen för off-target RAG-aktivitet. Faktum är att RAG1-bindningsställen i lymfocyter från mus och människa företrädesvis är utarmade på cRSSs (Teng et al., 2015), och vi föreslår att detta har uppstått på grund av selektiva tryck från genetiska omläggningar som sker utanför antigenreceptorgenerna. Repertoaren av RAG1-associerade TSSs är således skyddad från RAG-aktivitet under V(D)J-rekombination. Vi spekulerar i att de sällsynta cRSSs som behåller sin aktivitet och fortsätter att förmedla sällsynta ektopiska omarrangemang har bibehållits i genomet på grund av att de överlappar med reglerande eller funktionella sekvenser i sina värdloci, eller helt enkelt inte har utövat tillräckligt starka negativa konsekvenser för att selekteras bort.