Indicaties van breed-bereik 16S rDNA PCR
Breed-bereik 16S rDNA PCR kan zowel levensvatbare als niet-levensvatbare bacteriën detecteren, vergelijkbaar met qPCR. Het is ook klinisch nuttig wanneer andere technieken negatieve resultaten opleveren, bijvoorbeeld bij kweeknegatieve endocarditis, septische artritis, meningitis of langetermijninfecties.8 11 De geïdentificeerde bacteriën zijn vaak ongewoon, zeldzaam, moeilijk te kweken, of bacteriën waarvoor geen specifieke PCR beschikbaar is.8 9 Voorbeelden zijn de identificatie van Helicobacter sp als onderliggende oorzaak van osteomyelitis of Neisseria meningitidis als onverwachte oorzaak van septische artritis door middel van een breed 16S rDNA PCR, nadat andere microbiële diagnosetechnieken negatieve resultaten hadden opgeleverd.12 13
Het is ook mogelijk om onderscheid te maken tussen soorten: Ureaplasma spp bestaat uit twee bacteriestammen, Ureaplasma parvum en Ureaplasma urealyticum, die door kweek niet van elkaar te onderscheiden zijn en waarvan vermoed wordt dat zij elk een andere pathologie bij pasgeborenen veroorzaken.7 14 15 Met behulp van een grootschalige 16S rDNA PCR, gevolgd door sequentiebepaling, konden beide soorten worden gedifferentieerd en geïdentificeerd, wat het onderzoek naar soortspecifieke pathogeniteit ten goede kwam.8 16
Daarnaast kunnen met een grootschalige 16S rDNA PCR nog niet eerder gekarakteriseerde bacteriën worden geïdentificeerd. Dankzij breed-bereik 16S rDNA PCR konden Bartonella henselae en Tropheryma whippelii worden geïdentificeerd als de pathogenen die aan de basis liggen van respectievelijk de ziekte van catscratch en de ziekte van Whipple.17 18
Het brede bereik van breed-bereik 16S rDNA PCR maakt het echter kwetsbaar voor contaminatie. Al het in een monster aanwezige bacteriële DNA wordt geamplificeerd, ook dat wat onvermijdelijk in reagentia aanwezig is, hetgeen betekent dat geringe milieucontaminatie onmogelijk volledig kan worden geëlimineerd. Bij een hoog aantal thermische cycli zal dit geringe achtergrondverontreinigende DNA worden geamplificeerd en een vals-positief resultaat opleveren. Om dit risico te verkleinen moet sequencing worden uitgevoerd om onderscheid te maken tussen een echte ziekteverwekker en contaminanten (vaak bacteriën in het water waarvan het onwaarschijnlijk is dat ze ziekte veroorzaken). Met standaard-sequencingtechnieken kan alleen de meest dominante DNA-sequentie worden geïdentificeerd, wat betekent dat in monsters waarin meer dan één bacteriesoort aanwezig is (zoals ontlasting) de resultaten niet te interpreteren zijn. Dit betekent dat breed-bereik 16S rDNA PCR met standaard-sequencing niet bruikbaar is voor monsters van niet-steriele locaties.
Om het risico van besmetting nog verder te verkleinen, wordt het aantal thermische cycli verminderd in vergelijking met specifieke qPCR’s, maar dit heeft als bijkomend effect dat de gevoeligheid afneemt.19 Dit betekent dat breed-bereik 16S rDNA PCR altijd minder gevoelig zal zijn dan een goed ontworpen specifieke qPCR in de orde van grootte van 1-2 logs. Een laatste nadeel is dat deze methoden beperkt kunnen zijn tot onderzoeklaboratoria of gespecialiseerde laboratoria, wat betekent dat monsters soms moeten worden opgestuurd, waardoor de doorlooptijd toeneemt.16 Een vergelijking van de belangrijkste voor- en nadelen tussen kweekmethoden, qPCR en breed-bereik 16S rDNA PCR is weergegeven in tabel 1, en een stroomdiagram van voorgestelde onderzoeken voor vermoedelijke bacteriële steriele locatie-infecties met zowel qPCR als breed-breed-bereik 16S rDNA PCR is te zien in figuur 1C.
Samenvattend kan worden gesteld dat 16S rDNA PCR over een breed bereik een cruciale aanvulling is op microbiologische diagnostiek als tweede lijn wanneer infectie van een steriele locatie sterk wordt vermoed, maar kweken en qPCR voor de meest waarschijnlijke pathogenen negatief zijn gebleken. Vanwege het risico op detectie van bacteriële DNA-verontreiniging worden minder PCR-cycli uitgevoerd dan bij qPCR’s, wat resulteert in een minder gevoelige assay, zodat eerst qPCR’s moeten worden gebruikt (figuur 1C). Bij onderzoek zal 16S rDNA PCR verder worden gebruikt om nieuwe bacteriesoorten te identificeren, soortspecifieke pathogeniteit te karakteriseren en als gouden-standaard-test om mee te vergelijken bij de evaluatie van nieuwe assays. PCR wordt ook gebruikt in combinatie met geavanceerde technieken, zoals sequencing van de volgende generatie. Deze worden gebruikt om complexe microbiële populaties in de darm, de ontlasting, de vagina, de placenta, de longen en in het milieu te karakteriseren.20 Naarmate next-generation sequencing op basis van een breed-bereik 16S rDNA PCR betaalbaarder en op grotere schaal beschikbaar wordt, hebben deze technieken het potentieel om een therapie op maat mogelijk te maken naarmate ons inzicht in de complexe interactie tussen onszelf en onze microbiële gemeenschappen toeneemt.21 Breed bereik 16S rDNA PCR van microbiële darmgemeenschappen heeft bijvoorbeeld verschillende veranderingen geïdentificeerd bij aandoeningen zoals HIV, post-prematurale bevalling van pasgeborenen en ondervoeding.22-24 Naarmate we de potentiële therapeutische wegen verkennen die bij deze uiteenlopende aandoeningen aan het licht komen, is het waarschijnlijk dat breed bereik 16S rDNA PCR een hoeksteen van verder onderzoek zal zijn.