Tetramisole (Sigma T1512, een 10 mg/mL stockoplossing in H2O verdund tot ongeveer 100 μg/mL in eizouten) toevoegen is optioneel; dit middel verlamt de wormen en maakt het snijden gemakkelijker. Snijd onmiddellijk: als de wormen te sterk zijn samengetrokken, laten ze niet veel eieren vrij. Gebruik elke dag een vers scalpelmesje, aangezien deze snel corroderen. Een teveel aan tetramisol leidt tot de vorming van een neerslag in de NaOCl-oplossing.
Voor een maximale opbrengst kunnen meer eitjes vrijkomen door afgesneden wormen gedurende ongeveer 1 min te behandelen met een gelijk volume NaOCl-oplossing dat rechtstreeks aan de snijdruppel wordt toegevoegd. Zodra de eieren zijn vrijgegeven, voeg hetzelfde volume EGM als NaOCl gebruikt om verdere ei-beschadiging te voorkomen. Deze behandeling doodt pronucleaire stadia en beschadigt ééncellige embryo’s. De 3-min NaOCl-behandeling is nog steeds nodig voor de behandeling met chitinase voor een uniforme vertering. Voor eieren die vroeger dan het tweecellig stadium zijn, waarbij de schaal nog enigszins doorlaatbaar is, moet een gelijk volume EGM worden toegevoegd zodra de wormen worden doorgesneden. Daarna kunnen veel wormen de NaOCl- en chitinasebehandeling van 3 minuten overleven, en sommige zullen na de chitinasebehandeling en verwijdering van het vitelliene omhulsel nog in het ééncellig stadium verkeren als u snel werkt.
Voldoende transferpipetten worden gemaakt van SMI micropipettor capillairen van 5 tot 30 μL (Fisher 21-380-9C) of World Precision Instruments capillairen van 4 inch (1B100F-4), door dubbel te trekken boven een zeer kleine vlam. Dit wordt gedaan door eerst te verwarmen en voorzichtig te trekken om een dunne middensectie te maken, vervolgens kort af te koelen, en dan opnieuw te verwarmen zachtjes terwijl het capillair onder spanning wordt gehouden voor de laatste trek. De ideale trekbeweging levert een pipet op met een duidelijke schacht en een smal geleidelijk smaller wordend gedeelte van ongeveer 3/4-1 inch. Een kleine gasbrander kan worden gemaakt door een grote injectienaald in een kurk te monteren, met een schroefklem op het slangetje om de gasstroom te regelen. Als alternatief kunnen pipetten van gelijke grootte worden gemaakt door aan een automatische trekker te trekken. Voor gebruik, breken het capillair aan de gewenste tip, ongeveer 100-150 pm (drie of vier keer ei-diameter) door knijpen tussen je duimnagel en vingertop of met een scheermesje onder een ontleedmicroscoop. Een Microforge microscoop kan helpen bij het maken van consistente pipetten, maar het is niet nodig. Houd de diameter van de pipet klein om de vloeistofoverdracht te minimaliseren. Als de eitjes aan de binnenkant van de pipet blijven kleven, kunnen ze worden gerecupereerd door ze te spoelen met de NaOCl-oplossing of het EGM. Verwacht dat u vaak pipetten moet verwisselen en zorg dat u een goede voorraad hebt voordat u aan het werk gaat.
Als de chitinasedigestie niet binnen 8 minuten werkt, zal deze waarschijnlijk helemaal niet werken. De meest voorkomende problemen zijn het hypochloriet of de fysiologische toestand van de wormen (de eerste dag leggen lijkt taaiere eieren op te leveren). Hypochloriet moet een ongebruikte partij zijn, en het wordt meestal slecht een maand of zo voor de vervaldatum. Bewaar de voorraad in de koelkast in een donkere geventileerde fles, gevuld tot bijna de top. Meng een 3-mL buis vlak voor het begin en bewaar het op ijs; het zal werken voor ongeveer 3 uur en moet dan worden vervangen.
Na enzymatische behandeling en vooral na permeabilisatie, de embryo’s zijn vrij kleverig en zal klonteren; dit kan worden geminimaliseerd door pipetteren een of slechts een paar per keer. Kleine klonters kunnen worden opgebroken door ze een paar keer met een beetje kracht uit de pipet te persen.
Permeabilisatiepipetten worden op dezelfde manier met de hand getrokken als de transferpipetten, met behulp van Kwik-fil-injectiecapillairen (1B100F-4 van World Precision Instruments). De binnendraad kan helpen het vitelliene omhulsel door te snijden. De ideale trek geeft een lange geleidelijke taps toelopende dunne doorsnede, zodat deze op de gewenste diameter kan worden afgesneden. Pipetten worden gesneden met een vers scalpelmes op Parafilm onder de dissectiekijker. Een adapter voor de mond pipet kan worden gemaakt met small-bore Tygon buis schroefdraad op een injectiespuit naald bevestigd aan een mond buis. Vul de pipetpunt met EGM tot de bredere opening en test op de eerste partij van chitinazed embryo’s; recut de pipetpunt als het te klein is. De ideale grootte zal variëren naar gelang van de leeftijd van het embryo dat u probeert te krijgen; de zeer vroege stadia zijn kwetsbaarder en hebben behoefte aan een iets grotere boring; embryo’s groter dan acht cellen samen te drukken met minder schade en zal vaak komen uit de grotere pipetten met de vitelliene envelop intact. Dergelijke niet-gepermeabiliseerd embryo’s zal blijven ontwikkelen tot het uitkomen stadium.
Gebruik een spuit op de mond pipet voor het vullen en schoonmaken permeabilisatie pipetten; de eigenlijke permeabilisatie wordt gedaan door de mond luchtdruk. Pipetten kunnen enkele uren in lucht zitten zonder uit te drogen, omdat de boring zo klein is, maar als ze uitdrogen zullen ze uiteindelijk verstoppen. Bewaar pipetten (een goede is de moeite waard bewaken, en zal enkele weken duren) door het spoelen van de tip meerdere malen met gedestilleerd water en het ophangen van de pipetpunt in een buis steriel gedestilleerd water of 0,1 M HCl, met behulp van een tape “vlag” op de pipet, zodat het niet zinken in completely.
Als de pipet goed is, het duurt slechts een paar minuten om een partij van embryo’s permeabiliseren door individueel te zuigen ze in de pipet en voorzichtig uit te drijven hen. Ze zullen meer of minder samengedrukt tevoorschijn komen, afhankelijk van de binnendiameter van de pipet, maar binnen een paar minuten weer rond zijn. Als er veel lysis is bij permeabilisatie, was ofwel de ontsluiting onvolledig, ofwel de pipetopening te klein. Aangezien de celmembranen zijn vrij labiel voor 4-5 min na cytokinese begint, kunnen embryo’s gedevitelliniseerd tijdens en net na splitsing lyseren of blastomeren kunnen fuseren, later ondergaan van een abnormale tetrapolaire splitsing. Indien dit van cruciaal belang is, controleer dit dan tijdens een experiment en elimineer dergelijke embryo’s.
Een zeer fijne wimper (een traditioneel hulpmiddel voor elektronenmicroscopie) gemonteerd op een tandenstoker met lijm is het meest bevredigende hulpmiddel voor snelle handmatige blastomeer-scheiding; een glazen naald werkt ook, maar breekt gemakkelijk. Wimpers kunnen worden schoongemaakt met alcohol en een tissue. Blastomeren zullen lyseren als ze vlak na een deling worden gescheiden; 5-10 minuten na de splitsing is de beste tijd voor succesvolle manipulaties, tenzij u eerdere scheidingen nodig hebt. AB / P1 scheidingen zijn het gemakkelijkst. Vier-cel embryo’s kunnen ook worden gescheiden. Als alternatief, om P2 en EMS blastomeren te krijgen, kan P1 worden gescheiden na de eerste deling en EMS/P2 na de tweede. P-lineage blastomeren kunnen worden herkend aan hun relatieve grootte en hun lineaire rangschikking. Met een lage opbrengst kunnen MS, E, P3 en C worden gescheiden van de vier afstammelingen van een initieel geïsoleerd P1 blastomeer. Celidentificaties op basis van celgrootte kunnen worden bevestigd door te onderzoeken op verschillende celcyclusperioden.