Drosophila lijnen
Enkele lijnen (GMR57C10-Gal4, elav-Gal4, UAS-GCaMP6s, UAS-GCaMP6f, UAS-CD4:tdGFP, en UAS-tdTomato) werden verkregen van het Bloomington Stock Center. MAN-Gal4 (VT50660-AD; VT14014-DBD) en MDN-1-Gal4 (VT44845-DBD; VT50660-AD) werden geleverd door B. Dickson (Janelia Research Campus). DNa01-Gal4 (SS00731: GMR22C05-AD; GMR56G08-DBD), DNb06-Gal4 (SS02631: GMR20C04-AD; BJD113E03-DBD), DNg13-Gal4 (SS02538: BJD118A10-AD; BJD123E03-DBD), en DNg16-Gal4 (SS01543: BJD104A07-AD; BJD107F12-DBD) werden verstrekt door G. Rubin (Janelia Research Campus).
Generatie van Act88F: Rpr construct en vliegen
Actin88F: Rpr stammen (Act88F: Rpr vliegen) werden gegenereerd met behulp van een Actin88F: eGFP construct29. De Act88F: GFP lijn, die een eGFP construct aangedreven door een 2053 bp regio van de actin88F promotor huizen, werd verkregen van R. Benton (Universiteit van Lausanne). Een Act88F: Rpr construct werd gegenereerd door eerst met behulp van de volgende primer paar, een KpnI restrictie site toe te voegen aan de 5′ einde van een rpr cDNA kloon (IP02530, Drosophila Genomics Resource Center, Bloomington, IN) en een XbaI site aan de 3′ einde van de open reading frame, via een QuikChange Site-directed mutagenese kit (Agilent Technologies):
Forward primer 5′ AGACGGTACCATGGCAGTGGCATTC 3′
Reverse primer 5′ GCCGCGTCTAGATCATTGCGATGGCTT 3′
De Rpr-constructie werd vervolgens in de Act88F:eGFP construct achter de Act88F promotor in plaats van de eGFP sequentie. De Act88F: Rpr construct werd geïnjecteerd in attp18 Drosophila embryo’s voor PhiC31 integrase-gemedieerde site-specifieke transgenese35 (transgene landing site cytolocatie 6C12) door BestGene Inc. (Chino Hills, CA). Voor sommige experimenten werd dit transgen gecombineerd met UAS-GCaMP6s-p2A-tdTomato (gegenereerd in het laboratorium van M.H.D.).
Fluorescentie beeldvorming van indirecte vlucht spieren
Fluorescentie microscopie van hemi-thoraces werd uitgevoerd36,37. Kort gezegd, vliegen werden verdoofd en hun hoofden en buik werden vervolgens verwijderd. Thoraces werden ’s nachts gefixeerd in 4% paraformaldehyde bij 4 ° C en gespoeld in 1 × fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) de volgende dag. De specimens werden op een glasplaatje gelegd, bevroren in vloeibare stikstof en met een scheermesje over het midsagittale vlak doorgesneden. IFM’s werden gekleurd met Alexa-Fluor 568 Phalloidin (1:100 in PBS met 0,1% Triton-X (PBST)) overnacht bij 4 ° C, gespoeld met PBS en gevisualiseerd met EVOS ® FL Cell Imaging System (Life Technologies) bij × 4 vergroting. Voor whole-mount beeldvorming van IFM myofibrillen, vliegen werden bereid en thoraces doorgesneden zoals hierboven beschreven. Hemi-thoraces werden gekleurd met Alexa-Fluor 568 Phalloidin (1:100 in PBST) overnacht bij 4 ° C. Monsters werden gespoeld in PBS, gemonteerd met Vectashield (Vector Laboratories) en gevisualiseerd met behulp van een Leica TCS SPE RGBV confocale microscoop (Leica Microsystems) bij 100x vergroting.
Immunofluorescentie beeldvorming van de hersenen en ventrale zenuw strengen
Hersenen en VNCs werden ontleed uit 2-3 dpe vrouwelijke vliegen in PBS. Weefsels werden vervolgens gefixeerd gedurende 20 min in 4% paraformaldehyde in PBS bij kamertemperatuur. Na fixatie werden hersenen en VNC’s gewassen 2-3 keer in PBST met 1% Triton-X-100 (PBST) gedurende 10 minuten elk en vervolgens geïncubeerd bij 4 ° C gedurende de nacht in PBST. De monsters werden vervolgens in PBST met 5% normaal geitenserum (PBSTS) gedurende 20 min bij kamertemperatuur geplaatst. Vervolgens werden ze geïncubeerd met primaire antilichamen (konijn anti-GFP in 1:500, Thermofisher RRID: AB_2536526; muis anti-Bruchpilot/nc82 in 1:20, Developmental Studies Hybridoma Bank RRID: AB_2314866), verdund in PBSTS gedurende 48 uur bij 4 °C. Hersenen en VNC’s werden 2-3 keer gespoeld in PBST gedurende 10 min elk vóór incubatie met secundaire antilichamen (geit anti-rabbit secundair antilichaam geconjugeerd met Alexa 488 bij 1:500; Thermofisher; geit anti-muis secundair antilichaam geconjugeerd met Alexa 633 bij 1:500; Thermofisher) verdund in PBSTS gedurende 48 uur bij 4 ° C. Ten slotte werden hersenen en VNC’s gespoeld 2-3 keer gedurende 10 min elk in PBST en gemonteerd op draagglaasjes met brug dekglaasjes in Slowfade montage-media (Thermofisher).
Samples werden afgebeeld met behulp van een Carl Zeiss LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope met de volgende instellingen: × 20 vergroting, 8-bits dynamisch bereik, 2 × beeldmiddeling, 0,52 × 0,52 urn pixelgrootte, 0,57 urn z-stap interval. Standaardafwijking z-projecties van imaging volumes werden gemaakt met behulp van Fiji 38. Om GFP expressie in het centrale zenuwstelsel te vergelijken, werden laserintensiteit en PMT-versterkingen voor het groene kanaal constant gehouden over wild-type, A1 > GFP, en Act88F: GFP samples.
Imaging GFP expressie in beenspieren
De benen werden handmatig ontleed op het lichaam-coxa gewricht en gemonteerd op glasplaatjes met behulp van dubbelzijdige tape. Slowfade montage-media (Thermofisher) werd vervolgens toegevoegd aan de ruimte tussen het dekglaasje en de dia. Vervolgens werd de GFP-fluorescentie in het groene kanaal geregistreerd met behulp van een LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope (Zeiss). Laserintensiteit, PMT-versterkingen, en het scannen parameters werden constant gehouden over wild-type, MHC > GFP en Act88F: GFP dieren: × 20 vergroting, 8-bit dynamisch bereik, × 8 beeldmiddeling, 0,63 × 0,63 µm pixelgrootte, en 10 µm z-stap interval. Cuticular auto-fluorescentie werd ook opgenomen in het rode kanaal.
Thoracale dissectie voor VNC beeldvorming
Custom houders gebruikt om vliegen monteren tijdens de beeldvorming werden vervaardigd zoals eerder beschreven39. Voor VNC beeldvorming, werden deze stadia gewijzigd om (i) platte in plaats van gevouwen stalen vulplaatjes, en (ii) afgeschuinde hoekpunten om de sferische loopband zichtbaar voor optische stromingssensoren (Shapeways, ‘bestand’) te maken. Stalen vulplaten werden gemaakt van 0,001″ roestvrij staal, type 316 zacht gegloeid (McMaster-Carr, onderdeel # 317K11). De vulplaten werden geëtst (Etchit, Buffalo, MN) om rechthoekige gaten te maken zoals ‘hier’ uitgelegd. De shim ontwerp-bestand is te vinden ‘hier’.
Alle experimenten werden uitgevoerd op 1-3 dpe vrouwelijke vliegen opgegroeid bij 25 ° C op standaard maïsmeel voedsel op een 12 uur licht: 12 uur donker cyclus. Vliegen werden verdoofd bij 4 °C. Een vrouwelijke vlieg werd geselecteerd en, in sommige gevallen, werden de vleugels geknipt om de montage te vereenvoudigen. De vlieg dorsale thorax werd vervolgens geduwd door een gat in de stalen shim van de beeldvorming podium. Het podium werd vervolgens omgedraaid, werd UV-uithardende lijm (Bondic, Aurora, ON Canada) zorgvuldig toegepast rond de omtrek van de thorax en uitgehard door UV-verlichting (LED-200, Electro-Lite Co Bethel, CT USA). UV-lijm werd vervolgens gebruikt om het hoofd en het abdomen aan de onderzijde van het podium te bevestigen. Het podium werd vervolgens gevuld met extracellulaire zoutoplossing18. Onder een hoge-magnificatie dissectie microscoop (Leica M165C), werd een hypodermische naald (30 G, BD PrecisionGlide, Franklin Lakes, NJ USA) gebruikt om te snijden en til de cuticula van de dorsale thorax40, waarbij voorzichtig niet te breken de nek bindweefsel. Vervolgens werd in niet-Act88F: Rpr dieren, een paar doffe tang gebruikt om IFMs, voornamelijk te verwijderen uit de anterior-mediale regio van de thorax boven de darm (deze stap is niet nodig in Act88F: Rpr dieren). Dit proces bloot het dorsale oppervlak van de proventriculus-een grote bolvormige darm structuur. Met grote zorg, werd een paar super-fijne tang vervolgens gebruikt om te grijpen en de proventriculus op te heffen om veel van de darm (met inbegrip van de krop en speekselklieren) verplaatsen van de meer ventraal gelegen zenuwweefsel. Met de darm aldus verheven, ultra-fijne schaar (Fine Science Tools, Foster City, CA USA) werden gebruikt om het te doorsnijden op zijn voorste meest sectie. De proventriculus werd vervolgens teruggetrokken en een achterste incisie werd gemaakt om volledig te verwijderen deze delen van de darm, onthullend de onderliggende zenuwweefsel. Met name deze dissectie verwijdert ook de aorta, het beperken van hemolymfe stroom van de abdominale dorsale vat. Toch vonden we dat vliegen levensvatbaar waren en gedroegen zich tot 4 uur. In sommige gevallen zagen we dat darm-of spierweefsel zou beginnen met de VNC verduisteren tijdens de beeldvorming. Daarom moet los weefsel worden verwijderd in dit stadium terwijl het nemen van grote zorg niet aan de VNC verbreken. Na elke dissectie, onderzochten we de mate waarin het dier zijn poten bewoog in reactie op een luchtstroom of pakte een object met elk van zijn poten. Dit bleek een nauwkeurige voorspeller van het succes van de voorbereiding zijn. Om de kwaliteit van een dissectie te evalueren, onderzochten we de bewegingen van elke poot op de sferische loopband. Als een vlieg kon lopen in een gecoördineerde wijze, werd de dissectie als succesvol beschouwd. Anders werd het dier gecategoriseerd als het hebben van een ledemaat beweging deficiëntie. Dieren met meerdere disfunctionele benen werden gecategoriseerd als incapacitated.
2-foton microscopie tijdens gedrag
Experimenten werden uitgevoerd in de avond Zeitgeber tijd (Z.T.) en dieren werden meestal afgebeeld 30-60 min na dissectie. Fly houders werden bevestigd aan een verhoogd platform over de sferische loopband (Supplementary Fig. 3a). De VNC werd vervolgens gevestigd met behulp van microscoop oculairen en gepositioneerd in het midden van het field-of-view door 2-foton imaging.
De sferische loopband is een aluminium staaf met een bal-vormige gat gefreesd aan een uiteinde 22. We gefabriceerd 10 mm diameter schuim ballen (Last-A-Foam FR-7106, General Plastics, Burlington Way, WA USA) en handmatig gespot ze met behulp van een Rapidograph pen (Koh-I-Noor, Leeds, MA USA) tot hoog contrast kenmerken voor optische stroommetingen te bieden. Een 500-600 mL min-1 stroom van gefilterde en bevochtigde lucht werd door de houder met behulp van een digitale flow controller (Sierra Instruments, Monterey, CA USA). Bewegingen van de bal werden gemeten met behulp van twee optische stromingssensoren (ADNS3080) uitgerust met zoom lenzen (Computar MLM3X-MP, Cary, NC USA). De bal en vliegen werden verlicht met behulp van een paar IR-LED’s (850-nm piekgolflengte) gekoppeld aan optische vezels en collimator lenzen (ThorLabs, Newton, NJ USA). Optische flow metingen werden doorgegeven aan een microcontroller bord (Arduino Mega2560) te worden opgenomen met behulp van aangepaste Python-code. Tegelijkertijd werden video-opnamen van dieren die zich gedragen op de bal gemaakt met behulp van een IR-gevoelige firewire camera (Basler, Ahrensburg, Duitsland) bij ongeveer 30 fps.
We voerden 2-foton microscopie met behulp van een Bergamo II microscoop (ThorLabs) uitgerust met twee GaAsP PMT detectoren voor GCaMP6 en tdTomato beeldvorming en gekoppeld aan een Ti:Sapphire laser (MaiTai DeepSee, Newport Spectra-Physics, Santa Clara, CA USA) afgestemd op 930 nm. We gebruikten een Olympus 20× water-immersie objectief met 1,0 NA (Olympus, Center Valley, PA USA). De microscoop werd bestuurd met ThorImage software (ThorLabs). Coronale sectie beeldvorming experimenten werden uitgevoerd in Galvo-Galvo imaging-modus bij 6-9 Hz. Deze framerate varieerde met beeldgrootte die varieerde tussen 26,58 × 26,58 µm en 53,15 × 53,15 µm. Het laservermogen varieerde tussen 3 mW en 5,7 mW. Volumetrische beeldvorming is ook mogelijk met de juiste hardware (bijvoorbeeld Galvo-Resonance scanner en piëzo aangedreven objectief kraag).
Af en toe werd een pufje lucht gebruikt om loopgedrag uit te lokken. Deze pufjes werden digitaal gecodeerd (Honeywell AWM 3300 V, Morris Plains, NJ USA). Aangepaste ROS software gekoppeld via een analoge output apparaat (Phidgets, Calgary, Canada) naar ThorSync software (ThorLabs) werd gebruikt om optische flow metingen, gedrag videografie, lucht puff metingen, en 2-foton beeldacquisitie te synchroniseren. Voor coronale sectie beeldvorming, werd een piëzo kraag (Physik Instrumente, Karlsruhe, Duitsland) gebruikt om snelle z-as bewegingen van de microscoop objectief lens.
Om neurale activiteit te vergelijken tussen controle en Act88F: Rpr dieren, we 512 × 512 pixel beelden verkregen bij 1,7 fps met behulp van een constante laserintensiteit en PMT gain. Geselecteerde imaging regio’s werden empirisch gekozen als horizontale doorsneden bestaande uit oriëntatiepunten waargenomen op ~ 61-65 µm diepte in Supplementary Movie 1.
Comparing lopen met of zonder dissectie
Om de effecten van dissectie op de voortbeweging te evalueren, werden wild-type dieren onderworpen aan de volgende procedure. Dieren werden gemonteerd op beeldvormende stadia en zoutoplossing werd toegevoegd aan elk stadium. Slechts een willekeurige subset van dieren werd ontleed. Elke gemonteerde vlieg werd vervolgens geplaatst op de sferische loopband en zijn wandelgedrag werden opgenomen gedurende 30 minuten. Optische stroom werd opgenomen zoals hierboven beschreven. Om de kans op voortbeweging te verhogen, werd een 500 ms puls van 100% CO2 gericht op antennes van de vlieg met een een min inter-puls interval (0,05 ln min-1 met behulp van een mass flow controller; Vögtlin Instruments, Zwitserland).
Infrarood laser antennale stimulatie
Om te vergelijken lopen gedrag tussen Act88F: Rpr en controle dieren, stimuleerden we hun antennes met een 830 nm nabij infrarood laser (Schäfter + Kirchhoff, Duitsland). We eerst verdoofd 7-8 dpe vrouwelijke dieren bij 4 ° C en gemonteerd ze op beeldvorming podia. Vliegen werden vervolgens geacclimatiseerd voor 10 min. Voor elk experiment, een dier kreeg tien 2 s laser stimulatie pulsen (18,1 mW) om zijn rechter antenne met een 60 s inter-puls interval. Controle en Act88F: Rpr dieren werden getest in afwisseling aan de effecten van de circadiane tijd op gedragsvergelijkingen minimaliseren.
Statistieken
Steekproefgroottes voor dierlijke experimenten werden gekozen als volgt: we ten minste drie experimenten uitgevoerd om populatie en schaarse neurale opnamen te illustreren en uitgevoerd meer dan tien experimenten per groep bij het uitvoeren van statistische vergelijkingen. Een vooraf vastgestelde criteria van lage signaal-ruis fluorescentie signalen resulteerde in de verwijdering van twee MDN experimenten uit onze dataset. Geen randomisatie of blindering werd gebruikt. Voor antennale laser stimulatie, gegevens waren niet normaal verdeeld, dus Friedman en Mann-Whitney U-tests werden uitgevoerd. Schattingen van de variatie worden gepresenteerd als gemiddelde en bootstrapped 95%-betrouwbaarheidsintervallen.
Data-analyse
We analyseerden alle gegevens met behulp van aangepaste Python scripts. Omdat de data-acquisitie frequentie verschilde voor optische stroom, gedrag videografie, en 2-foton beeldvorming we geïnterpoleerd signalen aan die van de hoogste frequentie overeenkomen. Vervolgens werden optic flow gegevens afgevlakt met behulp van een lopend gemiddelde (venster = 200 ms) en vervolgens vertaald in rotaties s-1 voor anterior-posterior, mediaal-lateraal, en yaw assen 22. Om deze metingen meer intuïtief, rotaties s-1 werden vervolgens omgezet in mm s-1 (1 rot s-1 = 31,42 mm s-1) voor anterior-posterior (vforward) en mediaal-laterale (vside) bewegingen en in graden s-1 (1 rot s-1 = 360 ° s-1) voor yaw (wentatie) bewegingen 22.
De analyse van de voortbeweging in ontleed dieren (Supplementary Fig. 2) werd uitgevoerd als volgt. Vforward optische stroom gegevens voor 20 ontleed en 20 niet ontleed vliegen werden gedownsampled tot 1500 punten s-1 en afgevlakt met behulp van een lopend gemiddelde van de duur 0,2 s. Om het percentage tijd van voorwaarts/achterwaarts lopen, of zijwaarts lopen te berekenen werden twee drempels, -0.31 mm s-1 en +0.31 mm s-1, empirisch gedefinieerd om onderscheid te maken tussen stilstaan en voorwaarts (rechtsom) of achterwaarts (linksom) lopen, respectievelijk. Waarden boven 0.31 mm s-1 werden beschouwd als momenten van voorwaarts (rechtsom) lopen en waarden onder -0.31 mm s-1 werden beschouwd als momenten van achterwaarts (linksom) lopen. Optic flow waarden tussen deze drempels werden beschouwd als momenten van stilstand. Het percentage van de tijd lopen werd berekend als het aandeel van de datapunten waarin een dier werd niet beschouwd als stilstaand. Op dezelfde manier werden drempels van 10,8 en -10,8 graden s-1 gebruikt om momenten van draaien te definiëren. Een periode werd gedefinieerd als een ononderbroken periode van lopen of draaien.
Grote weefsel vervormingen kunnen optreden tijdens het gedrag. Daarom voerden we post-hoc pan-neuronale beeldregistratie (Fig. 2). We registreerden alle frames van een beeldvorming experiment om een referentiebeeld. Omdat de complexiteit van de vervormingen kan niet worden vastgelegd met behulp van eenvoudige parametrische bewegingsmodellen (bijvoorbeeld affiene transformaties), gebruikten we een niet-parametrische, variationele benadering, ontworpen om willekeurig complexe vervormingen te modelleren. We berekenden het bewegingsveld w tussen het referentiebeeld, aangeduid als Ir, en het beeld op tijdstip t, aangeduid als It, door het minimalisatieprobleem
waarbij D(w) een data fitting term is, de tweede term een regularisatie is die de gladheid van w bevordert door de gradiënt ∇w41 te bestraffen, Ω het discrete beelddomein is, en de parameter λ de bijdragen van de twee termen in evenwicht brengt.
GCaMP6s beelden vormen een uitdaging voor de schatting van beweging, omdat neurale activiteit produceert grote lokale intensiteit veranderingen. Daarom hebben we gebruik gemaakt van een extra activiteit onafhankelijke fluorofoor, tdTomato, en definieerde een data term van de vorm
De eerste term modelleert de standaard aanname van behoud van intensiteit langs het traject van elke pixel. Hij wordt gedefinieerd door
waarbij wij een (\ell _1\) norm gebruiken om een gedeeltelijke robuustheid voor intensiteitsveranderingen te verkrijgen42. De tweede term in Eq. (2) is een eigenschap matching constraint geïnspireerd door Revaud en medewerkers43, geschreven als
In de vergelijkingen (2)-(4) zijn Ir en It van het tdTomato kanaal. Het minimaliseren van de functie ϕ geeft de voorkeur aan bewegingsvectoren w(x) die dicht bij kenmerk-correspondenties m(x, Ir, It) liggen, berekend op een schaarse set van relevante sleutelpunten. We verkrijgen m met het feature matching-algoritme voorgesteld door Revaud en zijn medewerkers43 , dat speciaal is ontworpen om grote beeldvervormingen te verwerken. We berekenen m met behulp van het tdTomato beeldkanaal, zodat de overeenkomsten ook ongevoelig zijn voor de intensiteitsveranderingen tussen Ir en It. Bijgevolg wordt de schatting geleid door betrouwbare feature matches. De parameter γ balanceert de twee termen in Eq. (2).
Voor elk experiment hebben we de waarden voor λ en γ geoptimaliseerd met behulp van een raster zoeken naar horizontale doorsnede beelden van de VNC (Supplementary Fig. 4) te registreren. Als een objectieve functie voor optimalisatie, gebruikten we de gradiënt van het temporele gemiddelde beeld44. Kleine waarden van λ (d.w.z., λ < 1000), leidde af en toe tot artefacten in de geregistreerde beelden. Deze artefacten werden geassocieerd met sterke convergentie in het vectorveld w(x) (Supplementary Fig. 4c). Daarom hebben we empirisch gedefinieerd artefacten als clusters van pixels met ({\mathrm{div}},{\mathbf{w}}} links( {\mathbf{x}}} rechts) < – 1.2) en cardinaliteit >20 (we verkregen soortgelijke resultaten met cardinaliteit >5). Tenslotte hebben wij de λ- en γ-waarden gekozen als die welke geen artefacten vertonen en de hoogste gradiënt van het gemiddelde beeld hebben. Voorbeeld ongeregistreerde beelden, transformatie vectorvelden, en geregistreerde beelden van de drie geoptimaliseerde voorbeelden worden getoond in Supplementary Movie 5.
We losten het optimalisatieprobleem in Eq. (1) met een alternated direction methode van multiplier (ADMM) algoritme45. We introduceerden twee splitsing variabelen, geassocieerd met de regularisatie en de eigenschap matching termen, respectievelijk. Elk deelprobleem van het algoritme werd analytisch opgelost. Wij gebruikten delen van de inverse problemen bibliotheek beschreven in ref. 46. Een nabewerking op basis van gewogen mediaan filtering werd toegepast met behulp van de methode uit47.
In Fig. 2, gedragingen werden semi-automatisch geannoteerd, met behulp van een aangepaste Python module. Deze module stelt de gebruiker in staat om twee regio’s van belang (ROI’s) te selecteren op het eerste frame van de video. De eerste ROI wordt gebruikt om het lopen te detecteren en moet worden gepositioneerd over de metathoracic en mesothoracic benen. De tweede ROI is verantwoordelijk voor het detecteren van prothoracic been verzorging en moet worden geplaatst in de voorkant van de vlieg. Om beweging te detecteren in deze regio’s, zijn opeenvolgende frames afgetrokken. Resulterende differentiële beelden zijn dan mediaan wazig (straal = 5 pixels), om ruis te verminderen. Op basis van deze wazig beeld, is een drempel op het aantal niet-zeros pixels in elk van de twee ROI’s toegepast op binaire sequenties van verzorging en wandelen vlagen te extraheren. Merk op dat prothoracale beenbewegingen waargenomen tijdens het lopen worden genegeerd (d.w.z., grooming classificatie is ondergeschikt aan wandelen classificatie). Een hysteresis filter werd vervolgens toegepast op low-pass filter binaire gedrag sequenties en overgangen die zich voordoen over te weinig frames biologisch plausibel te verwijderen. Voorbeeld ROI’s en gedrag annotaties worden geïllustreerd in Supplementary Movie 6. Dit gedrag gegevens werden gebruikt in Fig. 2 zoals weergegeven in Supplementary Movie 2. Het werd geannoteerd met behulp van de volgende parameters: drempel voor wandelen = 400, drempel voor grooming = 5, hysteresis lengte voor wandelen = 8, hysteresis lengte voor grooming = 10.
Voor Fig. 2b, c, gebruikten we lineaire regressie om regio’s in de VNC geassocieerd met ofwel wandelen of grooming te vinden. Regressoren Xw en Xg (voor wandelen en poetsen, respectievelijk) werden geconstrueerd uit de twee gedragssequenties, Sw en Sg, met behulp van Eq. (5) door convolutie met een exponentieel afnemende Calcium signaal Impulse Response (CIR) afgeleid van de tijdconstante gemeten voor GCaMP6s (t½ = 1,1448 s)19.
De doelfuncties waren pixelgewijze ∆F/F-sporen, waarbij ∆F = Ft – F. Ft is de fluorescentie op tijdstip t. F is een basislijnfluorescentiesignaal gemeten als de gemiddelde pixelwaarde voor de eerste tien opeenvolgende GCaMP6sbeelden waarin geen cellulaire activiteit werd waargenomen (d.w.z, minimale en onveranderlijke GCaMP6s-fluorescentie).
De regressorgewichten werden berekend met behulp van Eq. (6).
waarbij y het pixelgewijze ∆F/F spoor is.
Figuur 2b, c toont heat maps van de regressor gewichten, ww voor wandelen en wg voor grooming, genormaliseerd op hun respectievelijke maxima. ROI 1 werd gekozen als een regio van de warmte-kaart met een hoog gewicht voor het verzorgen, maar een laag gewicht voor het lopen. ROI 2 werd gekozen als de ruimtelijke locatie met de hoogste waarde van ww. Elke ROI omvat een regio met een 15 pixel radius.
Om proces sparse neurale imaging data (Figs. 3-5) te identificeren, werden ROI’s eerst geselecteerd met behulp van aangepaste Python scripts die afhankelijk waren van OpenCV en Numpy bibliotheken. Om dit te doen, werd een referentiekader geselecteerd waarvoor de software geïdentificeerd alle potentiële ROI’s. Om dit te doen, werd de GCaMP6s beeld afgevlakt om achtergrondruis te verminderen en vervolgens een Otsu filter drempel werd toegepast op het beeld. Een erosiefactor werd vervolgens toegepast op alle in het beeld gedetecteerde objecten. Contouren van alle gedetecteerde objecten werden vervolgens aan de gebruiker gepresenteerd voor handmatige selectie. Zodra deze referentie ROI’s werden geselecteerd voor links en rechts neuronen, gebruikten we een cross-correlatie-gebaseerde beeld registratie algoritme 48 om de meest waarschijnlijke links en rechts ROI’s te identificeren voor elk beeld frame op basis van die handmatig geselecteerd op de referentie-frame. Een tweede script werd gebruikt om handmatig te controleren automatisch geselecteerde ROI’s en, indien onjuist, om alle potentiële ROI’s weer te geven binnen het frame voor handmatige selectie. Als erosie waarden malformed ROI’s opgeleverd, werd een ander script gebruikt om handmatig elliptische ROI’s van willekeurige oriëntatie op een bepaald frame te plaatsen. Ten slotte werden binaire ROI beelden gebruikt als een beeldmasker om gemiddelde fluorescentie signalen extraheren uit de oorspronkelijke GCaMP6s of tdTomato beelden. Deze signalen werden gerapporteerd als %∆R / R als in ref. 49 om de effecten van beweging op onze metingen te verminderen. Door de afwezigheid van stimuli, werd de basislijn R berekend als de minimale verhouding van GCaMP6 / tdTomato binnen een 2,5 s bin.
Om voorbijgaande toename van de activiteit te detecteren, ontwikkelden we een algoritme deels gebaseerd op ref. 50. We bepaalden eerst wanneer de eerste afgeleide van het %∆R / R signaal een drempel overschreden, die werd bepaald door het onderzoeken van alle afgeleide waarden voor een bepaalde neuron klasse (MDN, MAN, of A1). We redeneerden dat drempelwaarden karakteristiek en mogelijk verschillend voor elk type neuron, omdat fluorescentie dynamiek zijn gerelateerd aan intrinsieke fysiologische eigenschappen die kunnen verschillen tussen neuron klassen, maar niet over experimenten voor een enkele klasse. We hebben deze drempel ingesteld als de 97.5e percentiel voor MDNs en dMANs en de 90e percentiel voor A1 neuronen. Een lagere drempelwaarde werd gekozen voor A1 neuronen omdat veel meer fluorescentie transiënten werden waargenomen in A1 sporen. Deze transiënten zou zijn over het hoofd gezien met behulp van een 97.5e percentiel drempelwaarde. Om het begin van fluorescentie toename te identificeren vonden we de dichtstbijzijnde voorafgaande tijdstip waarop de afgeleide gekruist nul. Deze nuldoorgang wordt beschouwd als het tijdstip van een “gebeurtenis” die verband houdt met de geïdentificeerde fluorescentietoename. Gebeurtenissen die dicht bij elkaar werden gedetecteerd zonder tussenliggende nuldoorgang van de afgeleide werden gecomprimeerd tot één gebeurtenis die geassocieerd werd met het eerste tijdspunt. Er waren ~ 10 afzonderlijke experimenten per dier. Gebeurtenissen in de eerste en laatste 10 s van elk experiment werden niet in aanmerking genomen, omdat de presentatie van gegevens venster omvatte 10 s voor en 10 s na elke event.
Omdat links en rechts MDN en dMAN activiteiten sterk gecovariëerd (Supplementary Fig. 5), werd een extra stap uitgevoerd voor event detectie: als gebeurtenissen werden gedetecteerd in zowel links als rechts neuronen binnen 2 s van elkaar, werden beide gebeurtenissen behouden, anders wordt een gebeurtenis die voor neuron A (bijv, linker MDN) en niet neuron B (bijv. rechter MDN) werd ook toegevoegd aan neuron B’s gebeurtenissenbibliotheek.
In tegenstelling daarmee, linker en rechter A1 activiteiten waren niet sterk gecovarieerd. Daarom werden gebeurtenissen geassocieerd met een en niet het andere neuron. Om dit te bereiken, als een gebeurtenis werd gedetecteerd voor zowel links als rechts A1 neuronen binnen een tijdvenster van 0,25 s, geen van de gebeurtenissen werden gebruikt voor analyse.
% ΔR / R en optische stroom sporen gekoppeld aan elk evenement werden uitgelijnd door het instellen van de gebeurtenis tijdstippen op 0 s. Vervolgens berekenden we het gemiddelde en bootstrapped 95%-betrouwbaarheidsintervallen voor deze uitgelijnde sporen met behulp van de Python Seaborn bibliotheek. Optische stroom en %∆R / R metingen werden gedownsampled tot 500 waarden s-1 voor deze analyse. Om de duidelijkheid, werden %∆R / R sporen werden basislijn-afgetrokken om ze nul op het moment van het evenement in de samenvatting panelen (Figs. 3d, 4d en 5d, e). Controle, geschudde gegevens (grijze sporen) werden berekend door in plaats daarvan willekeurige tijdstippen toe te wijzen in plaats van echte, geïdentificeerde gebeurtenissen. Deze willekeurige tijdstippen werden behandeld als echte gebeurtenissen en hun gemiddelde en bootstrapped 95%-betrouwbaarheidsintervallen werden berekend en uitgezet voor vergelijking.
Covariantie analyse (Supplementary Fig. 5) werd uitgevoerd met behulp van een aangepaste Python script dat afhankelijk was van de Matplotlib en Numpy bibliotheken. Scatter plots werden berekend om links en rechts neuron %∆R / R waarden van alle experimenten te vergelijken voor elke vlieg afzonderlijk. Pearson’s r waarden worden gerapporteerd als gemiddelde ± standaard deviation.
Event-gerelateerde gedragingen (Supplementary Movies 8, 10, 12 en 13) werden handmatig geselecteerd uit automatisch gedetecteerde gebeurtenissen zoals hierboven beschreven. Voor dMANs, gebeurtenissen werden geselecteerd uit die het verschil in anterior-posterior bal rotaties gemaximaliseerd tussen 1 s voor en 2 s na de gebeurtenis. Voor MDNs, gebeurtenissen werden geselecteerd uit die die anterior-posterior bal rotaties geminimaliseerd tot 2 s na de gebeurtenis. Voor A1 neuronen, werden gebeurtenissen geselecteerd uit die dat de gemiddelde yaw bal rotaties (positief voor links A1 neuron voorbeelden en negatief voor rechts A1 neuron voorbeelden) gemaximaliseerd voor maximaal 2 s na de events.
In supplementaire Fig. 8, reacties op nabij-infrarood laser stimulatie werden gemiddeld over 10 proeven voor elk dier. Optische stroom werd gedownsampled tot 500 waarden s-1. Gemiddelde en 95% bootstrapped betrouwbaarheidsintervallen voor optische stroom sporen werden gemeten en geplot met behulp van de Python Seaborn bibliotheek. De Python Scipy bibliotheek werd gebruikt om Friedman en Mann-Whitney U-tests.
uit te voeren