Tetramisolin (Sigma T1512, 10 mg/ml kantaliuos H2O:ssa laimennettuna noin 100 μg/ml:ksi kananmunasuolassa) lisääminen on vapaaehtoista; tämä lääke halvaannuttaa madot ja helpottaa leikkaamista. Leikataan välittömästi: jos matoja supistetaan liikaa, ne eivät vapauta monia munia. Käytä joka päivä uutta skalpellin terää, sillä ne ruostuvat nopeasti. Ylimääräinen tetramisoli johtaa NaOCl-liuokseen muodostuvaan sakkaan.
Mahdollisimman suuren saannon saavuttamiseksi munia voidaan vapauttaa enemmän käsittelemällä leikattuja matoja noin 1 minuutin ajan vastaavalla määrällä NaOCl-liuosta, joka on lisätty suoraan leikkauspisaraan. Heti kun munat ovat vapautuneet, lisätään sama määrä EGM:ää kuin käytettyä NaOCl:ää munien lisävahinkojen estämiseksi. Tämä käsittely tappaa pronukleaariset vaiheet ja vahingoittaa yksisoluisia alkioita. 3 minuutin NaOCl-käsittely on edelleen tarpeen ennen kitinaasikäsittelyä tasaisen pilkkoutumisen varmistamiseksi. Kahta soluvaihetta varhaisemmille munille, joissa kuori on vielä jonkin verran läpäisevä, lisätään yhtä suuri määrä EGM:ää heti, kun madot on leikattu. Tämän jälkeen monet selviävät 3 minuutin NaOCl- ja kitinaasikäsittelystä, ja jotkut ovat vielä yhden solun vaiheessa kitinaasikäsittelyn ja vitelliinikuoren poistamisen jälkeen, jos toimitaan nopeasti.
Tyydyttävät siirtopipetit valmistetaan SMI:n mikropipettien 5-30 μl:n kapillaareista (Fisher 21-380-9C) tai World Precision Instrumentsin 4-tuuman kapillaareista (1B100F-4) kaksoispainamalla hyvin pienen liekin päällä. Tämä tapahtuu siten, että ensin kuumennetaan ja vedetään varovasti, jotta saadaan aikaan ohut keskiosuus, sitten jäähdytetään lyhyesti ja sitten lämmitetään uudelleen varovasti pitäen kapillaari jännitteisenä viimeistä vetoa varten. Ihanteellinen veto tuottaa pipetin, jossa on selvä varsi ja kapea, vähitellen kapeneva, noin 3/4-1 tuuman mittainen osa. Pieni kaasupoltin voidaan valmistaa asentamalla suuri ruiskuneula korkkiin ja kiinnittämällä letkuun ruuvipuristin kaasun virtauksen säätämiseksi. Vaihtoehtoisesti tasakokoisia pipettejä voidaan valmistaa vetämällä automaattisella vetolaitteella. Ennen käyttöä katkaise kapillaari haluttuun kärkeen, noin 100-150 μm (kolme tai neljä kertaa munan halkaisija) nipistämällä se peukalonkynnen ja sormenpään väliin tai käyttämällä partaterää leikkuumikroskoopin alla. Microforge-mikroskooppi voi auttaa johdonmukaisten pipettien tekemisessä, vaikka se ei ole välttämätön. Pidä pipetin halkaisija pienenä nesteen siirtymisen minimoimiseksi. Jos munia tarttuu pipetin sisäpuolelle, monet niistä voidaan ottaa talteen huuhtelemalla NaOCl-liuoksella tai EGM:llä työn edetessä. Varaudu siihen, että pipettejä joudut vaihtamaan usein, ja hanki hyvä varasto ennen työskentelyä.
Jos kitinaasimädätys ei toimi 8 minuutissa, se ei todennäköisesti toimi lainkaan. Yleisimmät ongelmat johtuvat hypokloriitista tai matojen fysiologisesta tilasta (ensimmäisen päivän muninta näyttää antavan kovempia munia). Hypokloriitin pitäisi olla vanhentumatonta erää, ja siitä tulee yleensä huono noin kuukausi ennen viimeistä käyttöpäivää. Säilytä varastoa jäähdytettynä pimeässä tuuletetussa pullossa, joka on täytetty lähes yläreunaan asti. Sekoita 3 ml:n putki juuri ennen aloittamista ja pidä se jäässä; se toimii noin 3 tuntia, minkä jälkeen se on vaihdettava.
Ensiymikäsittelyn ja erityisesti permeabiloinnin jälkeen alkiot ovat melko tahmeita ja paakkuuntuvat; tämä voidaan minimoida pipetoimalla yksi tai vain muutama kerrallaan. Pienet paakut voidaan hajottaa karkottamalla pipetistä pienellä voimalla muutaman kerran.
Permeabilointipipetit vedetään käsin samalla tavalla kuin siirtopipetit, käyttäen Kwik-fil-injektiokapillaareja (1B100F-4 World Precision Instrumentsilta). Sisäkierre voi auttaa leikkaamaan vitelliinikuoren. Ihanteellinen veto antaa ohueen osaan pitkän asteittaisen kapeneman, jotta se voidaan leikata haluttuun halkaisijaan. Pipetit leikataan tuoreella skalpellin terällä Parafilmin päällä leikkuuskoopin alla. Suupipetille voidaan tehdä sovitin pienikokoisesta Tygon-letkusta, joka kierretään suuputkeen kiinnitettyyn ruiskuneulaan. Täytä pipetin kärki EGM:llä takaisin laajempaan reikään ja testaa ensimmäisellä kitinatseeratulla alkioerällä; leikkaa pipetin kärki uudelleen, jos se on liian pieni. Ihanteellinen koko vaihtelee sen mukaan, minkä ikäisiä alkioita yrität saada; aivan alkuvaiheessa olevat alkiot ovat hauraampia ja tarvitsevat hieman suuremman suuaukon; yli kahdeksan solua olevat alkiot pakkautuvat vähemmän vaurioituneina ja tulevat usein ulos suuremmista pipeteistä niin, että vitelliinikuori on ehjä. Tällaiset ei-permeabiloidut alkiot jatkavat kehittymistään kuoriutumisvaiheeseen asti.
Käytä suupipetin ruiskua permeabilointipipettien täyttämiseen ja puhdistamiseen; varsinainen permeabilointi tehdään suun ilmanpaineella. Pipetit voivat istua ilmassa useita tunteja kuivumatta, koska niiden reikä on niin pieni, mutta kuivuessaan ne lopulta tukkeutuvat. Säilytä pipetit (hyvää pipettiä kannattaa varoa, ja se kestää useita viikkoja) huuhtelemalla kärki useita kertoja tislatulla vedellä ja ripustamalla pipetin kärki putkeen, jossa on steriiliä tislattua vettä tai 0,1 M HCl:ää, käyttäen teippi-”lippua” pipetissä, jotta se ei uppoa kokonaan.
Jos pipetti on kunnossa, permeabiloimalla erä alkioita imemällä ne yksitellen pipettiin ja karkottamalla ne ulos varovasti, kestää vain muutaman minuutin. Ne tulevat ulos enemmän tai vähemmän puristuneina riippuen pipetin sisähalkaisijasta, mutta pyöristyvät uudelleen muutamassa minuutissa. Jos permeabiloinnin yhteydessä syntyy paljon lyysiä, joko pilkkominen oli epätäydellistä tai pipetin reikä oli liian pieni. Koska solukalvot ovat sytokinesiksen alkamisen jälkeen 4-5 minuutin ajan varsin labiloivia, hajautumisen aikana ja heti sen jälkeen devitellinoituneet alkiot voivat lysääntyä tai blastomeerit voivat sulautua toisiinsa ja käydä myöhemmin läpi epänormaalin tetrapolaarisen hajautumisen. Jos se on kriittistä, se on tarkistettava kokeen aikana ja poistettava tällaiset alkiot.
Hyvin hieno silmäripsi (perinteinen elektronimikroskooppityökalu), joka on kiinnitetty hammastikkuun liimalla, on tyydyttävin työkalu nopeaan manuaaliseen blastomeerien erotteluun; lasineula toimii myös, mutta se katkeaa helposti. Ripset voidaan puhdistaa alkoholilla ja nenäliinalla. Blastomeerit liukenevat, jos ne erotetaan heti jakautumisen jälkeen; 5-10 minuuttia jakautumisen jälkeen on paras aika onnistuneeseen manipulaatioon, ellei erottelua tarvita aikaisemmin. AB/P1-erotukset ovat helpoimpia. Myös nelisoluiset alkiot voidaan erottaa. Vaihtoehtoisesti P2- ja EMS-blastomeerien saamiseksi P1 voidaan erottaa ensimmäisen jakautumisen jälkeen ja EMS/P2 toisen jakautumisen jälkeen. P-linjan blastomeerit voidaan tunnistaa suhteellisen koon ja niiden lineaarisen järjestyksen perusteella. Alun perin eristetyn P1-blastomeerin neljästä jälkeläisestä voidaan erottaa MS, E, P3 ja C, jos saanto on alhainen. Solujen koon perusteella tehdyt solujen tunnistukset voidaan vahvistaa tutkimalla, onko solusyklin jaksoissa eroja.