Drosophila-linjat
Monia linjoja (GMR57C10-Gal4, elav-Gal4, UAS-GCaMP6s, UAS-GCaMP6f, UAS-CD4:tdGFP ja UAS-tdTomato) saatiin Bloomington Stock Centeristä. MAN-Gal4 (VT50660-AD; VT14014-DBD) ja MDN-1-Gal4 (VT44845-DBD; VT50660-AD) saatiin B. Dicksonilta (Janelia Research Campus). DNa01-Gal4 (SS00731: GMR22C05-AD; GMR56G08-DBD), DNb06-Gal4 (SS02631: GMR20C04-AD; BJD113E03-DBD), DNg13-Gal4 (SS02538: BJD118A10-AD; BJD123E03-DBD) ja DNg16-Gal4 (SS01543: BJD104A07-AD; BJD107F12-DBD) toimitti G. G. G. Rubin (Janelia Research Campus).
Act88F:Rpr-konstruktion ja kärpästen tuottaminen
Actin88F:Rpr-kannat (Act88F:Rpr-kärpäset) tuotettiin käyttämällä Actin88F:eGFP-konstruktiota29. Act88F:GFP-linja, jossa on eGFP-konstruktio, jota ohjaa aktin88F-promoottorin 2053 bp:n alue, saatiin R. Bentonilta (Lausannen yliopisto). Act88F:Rpr-konstruktio luotiin käyttämällä ensin seuraavaa alukeparia KpnI-rajoituskohdan lisäämiseksi rpr-cDNA-kloonin (IP02530, Drosophila Genomics Resource Center, Bloomington, IN) 5′-päähän ja XbaI-kohdan lisäämiseksi rpr-cDNA-kloonin (IP02530, Drosophila Genomics Resource Center, Bloomington, IN) 5′-päähän ja XbaI-kohdan lisäämiseksi avoimeen lukukehyksen 3′-päähän QuikChange Site-directed mutagenesis kitin (Agilent Technologies) avulla:
Forward primer 5′ AGACGGTACCATGGCAGTGGCATTC 3′
Reverse primer 5′ GCCGCGTCTAGATCATTGCGATGATGGCTT 3′
Rpr-konstruktio splikoitiin tämän jälkeen Act88F:ään:eGFP-konstruktioon Act88F-promoottorin taakse eGFP-sekvenssin tilalle. Act88F:Rpr-konstruktio injektoitiin attp18 Drosophila-alkioihin PhiC31-integraasivälitteistä paikkaspesifistä transgeneesiä35 varten (transgeenin laskeutumispaikka sytolokaatio 6C12) BestGene Inc. (Chino Hills, CA). Joissakin kokeissa tämä siirtogeeni yhdistettiin UAS-GCaMP6s-p2A-tdTomatoon (tuotettu M.H.D.:n laboratoriossa).
Epäsuorien lentolihasten fluoresenssikuvaus
Suoritettiin hemi-torakoiden fluoresenssimikroskopiaa36,37. Lyhyesti sanottuna kärpäset nukutettiin ja niiden pää ja vatsa poistettiin. Thoraces kiinnitettiin yön yli 4 %:ssa paraformaldehydissä 4 °C:ssa ja huuhdeltiin seuraavana päivänä 1 × fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Näytteet asetettiin lasilevylle, pakastettiin nestemäisessä typessä ja puolitettiin keskisagittaalitasossa partaveitsen terällä. IFM:t värjättiin Alexa-Fluor 568 Phalloidinilla (1:100 PBS:ssä, jossa oli 0,1 % Triton-X (PBST)) yön yli 4 °C:ssa, huuhdeltiin PBS:llä ja visualisoitiin EVOS® FL Cell Imaging System -järjestelmällä (Life Technologies) × 4 suurennoksella. IFM-myofibrillien kokomount-kuvantamista varten kärpäset valmisteltiin ja thoracit puolitettiin edellä kuvatulla tavalla. Hemi-toraksit värjättiin Alexa-Fluor 568 Phalloidinilla (1:100 PBST:ssä) yön yli 4 °C:ssa. Näytteet huuhdeltiin PBS:llä, kiinnitettiin Vectashieldillä (Vector Laboratories) ja visualisoitiin Leica TCS SPE RGBV konfokaalimikroskoopilla (Leica Microsystems) 100-kertaisella suurennoksella.
Aivojen ja ventraalisten hermosäikeiden immunofluoresenssikuvaus
Aivot ja VNC:t paloiteltiin 2-3 dpe:n ikäisistä naaraskärpäsistä PBS:ssa. Tämän jälkeen kudokset kiinnitettiin 20 minuutiksi 4 %:n paraformaldehydiin PBS:ssä huoneenlämmössä. Fiksoinnin jälkeen aivot ja VNC:t pestiin 2-3 kertaa PBS:ssä, jossa oli 1 % Triton-X-100 (PBST), 10 minuutin ajan kukin ja inkuboitiin sitten 4 °C:ssa yön yli PBST:ssä. Tämän jälkeen näytteet laitettiin PBST:hen, jossa oli 5 % normaalia vuohen seerumia (PBSTS), 20 minuutiksi huoneenlämpötilaan. Sen jälkeen näytteitä inkuboitiin ensisijaisilla vasta-aineilla (kanin anti-GFP 1:500, Thermofisher RRID: AB_2536526; hiiren anti-Bruchpilot/nc82 1:20, Developmental Studies Hybridoma Bank RRID: AB_2314866), jotka oli laimennettu PBSTS:ssä 48 tunnin ajan 4 °C:ssa. Aivot ja VNC:t huuhdeltiin 2-3 kertaa PBST:ssä 10 minuutin ajan kumpikin ennen inkubointia sekundääristen vasta-aineiden kanssa (vuohen anti-kaniinin sekundäärinen vasta-aine, konjugoitu Alexa 488:lla 1:500; Thermofisher; vuohen anti-hiiren sekundäärinen vasta-aine, konjugoitu Alexa 633:lla 1:500; Thermofisher), jotka oli laimennettu PBSTS:ään 48 tunnin ajan 4 °C:ssa. Lopuksi aivot ja VNC:t huuhdeltiin 2-3 kertaa kumpikin 10 minuutin ajan PBST:ssä ja kiinnitettiin siltakansilevyillä varustettuihin objektiolevyihin Slowfade-kiinnitysmediassa (Thermofisher).
Näytteet kuvattiin Carl Zeiss LSM 700 laserkeilaavalla konfokaalimikroskoopilla seuraavilla asetuksilla: ×20 suurennos, 8-bittinen dynaaminen alue, 2-kertainen kuvan keskiarvoistus, 0,52 × 0,52 μm pikselikoko, 0,57 μm z-askeliväli. Kuvantamistilavuuksien z-projektioiden keskihajonta tehtiin Fiji38 -ohjelmalla. GFP-ekspression vertailemiseksi keskushermostossa laserintensiteetti ja vihreän kanavan PMT-vahvistus pidettiin vakiona villityyppi-, A1 > GFP- ja Act88F:GFP-näytteissä.
GFP-ekspression kuvantaminen säärilihaksissa
Jalat leikattiin manuaalisesti irti vartalon ja koxan nivelen kohdalta, ja ne kiinnitettiin lasilevyille kaksipuolisen teipin avulla. Tämän jälkeen peitelevyn ja objektilasin väliseen tilaan lisättiin Slowfade mounting-media (Thermofisher). Tämän jälkeen rekisteröitiin GFP:n fluoresenssi vihreällä kanavalla LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope -laitteella (Zeiss). Laserin voimakkuus, PMT-vahvistukset ja skannausparametrit pidettiin vakiona villityypin, MHC > GFP:n ja Act88F:GFP:n eläimissä: ×20 suurennos, 8-bittinen dynaaminen alue, ×8 kuvan keskiarvoistaminen, 0,63 × 0,63 µm pikselikoko ja 10 µm z-askel-väli. Cutikulaarinen autofluoresenssi rekisteröitiin myös punaisella kanavalla.
Thorakaalin dissektio VNC-kuvantamista varten
Kärpästen kiinnittämiseen kuvantamisen aikana käytetyt mukautetut pidikkeet valmistettiin aiemmin kuvatulla tavalla39. VNC-kuvantamista varten näitä lavoja muutettiin siten, että niissä oli (i) litteät eikä taitetut teräslevyt ja (ii) viistetyt kärjet, jotta pallomainen juoksumatto saatiin näkyviin optisille virtausantureille (Shapeways, ’file’). Teräksiset aluslevyt valmistettiin 0,001 tuuman ruostumattomasta teräksestä, tyyppi 316, pehmeäksi hehkutettu (McMaster-Carr, osa #2317K11). Aluslevyt syövytettiin (Etchit, Buffalo, MN) suorakulmaisten reikien luomiseksi, kuten ”tässä” selitetään. Shim-suunnittelutiedosto löytyy ’täältä’.
Kaikki kokeet suoritettiin 1-3 dpe naaraskärpäsillä, jotka kasvatettiin 25 °C:ssa vakiomuotoisella maissijauhoruokinnalla 12 h valoa:12 h pimeää -jaksossa. Kärpäset nukutettiin 4 °C:ssa. Naaraskärpänen valittiin, ja joissakin tapauksissa sen siivet leikattiin kiinnittämisen helpottamiseksi. Kärpäsen selkäpuolinen rintakehä työnnettiin sitten kuvantamisalustan teräslevyssä olevan reiän läpi. Sitten pöytä käännettiin, UV-kovetteista liimaa (Bondic, Aurora, ON Canada) levitettiin varovasti rintakehän ympärille ja kovetettiin UV-valaistuksessa (LED-200, Electro-Lite Co. Bethel, CT USA). Tämän jälkeen pää ja vatsa kiinnitettiin UV-liimalla lavan alapuolelle. Lava täytettiin sitten solunulkoisella suolaliuoksella18. Suuren suurennoksen leikkelymikroskoopin (Leica M165C) alla hypodermisellä neulalla (30 G, BD PrecisionGlide, Franklin Lakes, NJ, USA) leikattiin ja nostettiin pintakalvo pois selkärangasta40 varoen katkaisemasta kaulan sidekudosta. Tämän jälkeen muissa kuin Act88F:Rpr-eläimissä käytettiin tylppää pihtejä IFM:ien poistamiseksi pääasiassa rintakehän etu-mediaaliselta alueelta suoliston yläpuolelta (tämä vaihe on tarpeeton Act88F:Rpr-eläimissä). Tämä prosessi paljastaa proventriculuksen – suuren sipulimaisen suolistorakenteen – selkäpinnan. Tämän jälkeen proventriculukseen tartuttiin ja sitä nostettiin erittäin varovasti superhienoilla pihdeillä, jotta suuri osa suolistosta (mukaan lukien sato ja sylkirauhaset) saatiin siirrettyä pois ventraalisemmin sijaitsevasta hermokudoksesta. Kun suolisto oli näin koholla, käytettiin erittäin hienoja leikkuusaksia (Fine Science Tools, Foster City, CA, USA) sen leikkaamiseksi sen etummaisesta osasta. Sen jälkeen proventriculus kuorittiin taaksepäin ja tehtiin posteriorinen viilto, jolla nämä suolen osat poistettiin kokonaan ja paljastettiin alla oleva hermokudos. Tämä leikkaus poisti myös aortan, mikä rajoitti hemolymfavirtausta vatsan selkäverisuonesta. Tästä huolimatta havaitsimme, että kärpäset olivat elinkelpoisia ja käyttäytyivät jopa 4 tunnin ajan. Joissakin tapauksissa havaitsimme, että suolisto- tai lihaskudos alkoi peittää VNC:tä kuvantamisen aikana. Siksi löysä kudos olisi poistettava tässä vaiheessa ja samalla olisi huolehdittava siitä, että VNC ei katkea. Kunkin paloittelun jälkeen tarkastelimme, missä määrin eläin liikutti jalkojaan vastauksena ilman puhallukseen tai tarttui esineeseen kummallakin jalallaan. Tämä osoittautui tarkaksi ennusteeksi preparoinnin onnistumisesta. Leikkauksen laadun arvioimiseksi tarkastelimme kunkin jalan liikkeitä pallomaisella juoksumatolla. Jos kärpänen pystyi kävelemään koordinoidusti, leikkelyä pidettiin onnistuneena. Muussa tapauksessa eläin luokiteltiin eläimeksi, jonka raajojen liikkeissä oli puutteita. Eläimet, joilla oli useita toimintahäiriöisiä jalkoja, luokiteltiin toimintakyvyttömiksi.
2-fotonimikroskooppi käyttäytymisen aikana
Kokeet suoritettiin iltaisin Zeitgeber-aikana (Z.T.), ja eläimet kuvattiin tyypillisesti 30-60 minuuttia leikkelyn jälkeen. Kärpäspidikkeet kiinnitettiin korotetulle alustalle pallomaisen juoksumaton päälle (Täydentävä kuva 3a). VNC paikannettiin sitten mikroskoopin okulaareilla ja sijoitettiin 2-fotonikuvantamisella näkökentän keskelle.
Pallomainen juoksumatto on alumiinitanko, jonka toiseen päähän on jyrsitty pallonmuotoinen reikä22. Valmistimme halkaisijaltaan 10 mm:n vaahtomuovipalloja (Last-A-Foam FR-7106, General Plastics, Burlington Way, WA USA) ja täplättiin ne manuaalisesti Rapidograph-kynällä (Koh-I-Noor, Leeds, MA USA), jotta saatiin kontrastikkaita piirteitä optisia virtausmittauksia varten. Pidikkeen läpi johdettiin 500-600 ml min-1 suodatettua ja kostutettua ilmaa digitaalisen virtaussäätimen (Sierra Instruments, Monterey, CA, USA) avulla. Pallon liikkeet mitattiin kahdella optisella virtausanturilla (ADNS3080), jotka oli varustettu zoom-objektiiveilla (Computar MLM3X-MP, Cary, NC USA). Pallo ja kärpänen valaistiin parilla IR-LEDillä (850 nm:n huippuaallonpituus), jotka oli kytketty optisiin kuituihin ja kollimaattorilinsseihin (ThorLabs, Newton, NJ, USA). Optiset virtausmittaukset välitettiin mikrokontrollerilevylle (Arduino Mega2560) tallennettavaksi räätälöidyn Python-koodin avulla. Samanaikaisesti tehtiin videotallenteita eläinten käyttäytymisestä pallon päällä käyttäen IR-herkkää firewire-kameraa (Basler, Ahrensburg, Saksa) noin 30 fps:n nopeudella.
Suoritimme 2-fotonimikroskopian Bergamo II -mikroskoopilla (ThorLabs), joka oli varustettu kahdella GaAsP PMT -ilmaisimella GCaMP6- ja tdTomato-kuvantamista varten ja joka oli kytketty 930 nm:iin viritettyyn Ti:Sapphire-laseriin (MaiTai DeepSee, Newport Spectra-Physics, Santa Clara, CA USA). Käytimme Olympuksen 20× vesi-immersio-objektiivia, jossa on 1,0 NA (Olympus, Center Valley, PA, USA). Mikroskooppia ohjattiin ThorImage-ohjelmistolla (ThorLabs). Koronaalisen leikkauksen kuvauskokeet suoritettiin Galvo-Galvo-kuvaustilassa 6-9 Hz:n taajuudella. Kuvataajuus vaihteli kuvakoon mukaan, joka vaihteli 26,58 × 26,58 µm:n ja 53,15 × 53,15 µm:n välillä. Laserin teho vaihteli 3 mW:n ja 5,7 mW:n välillä. Volumetrinen kuvantaminen on myös mahdollista sopivalla laitteistolla (esim. galvo-resonanssiskannerilla ja pietso-ohjatulla objektiivikauluksella).
Tällöin käytettiin puhallusta ilmaa kävelykäyttäytymisen aikaansaamiseksi. Nämä puhallukset koodattiin digitaalisesti (Honeywell AWM 3300 V, Morris Plains, NJ USA). Räätälöityä ROS-ohjelmistoa, joka oli liitetty analogisen lähtölaitteen (Phidgets, Calgary, Kanada) kautta ThorSync-ohjelmistoon (ThorLabs), käytettiin synkronoimaan optiset virtausmittaukset, käyttäytymisen videokuvaus, ilmapuhallusmittaukset ja 2-fotonikuvien hankinta. Koronaalileikkauksen kuvantamista varten käytettiin Piezo-kaulusta (Physik Instrumente, Karlsruhe, Saksa) mikroskoopin objektiivin nopeiden z-akselin liikkeiden ohjaamiseen.
Vertaillaksemme neuraalista aktiivisuutta kontrolli- ja Act88F:Rpr-eläinten välillä otimme 512 × 512 pikselin kuvia 1,7 fps:n nopeudella käyttäen vakiolaser-intensiteettiä ja PMT-vahvistusta. Valitut kuvausalueet valittiin empiirisesti vaakasuuntaisiksi leikkauksiksi, jotka koostuivat ~61-65 µm:n syvyydessä havaituista kiintopisteistä Supplementary Movie 1:ssä.
Kävelyn vertailu paloittelun kanssa tai ilman paloittelua
Paloittelun vaikutusten arvioimiseksi liikkumiseen villiintyneille eläimille tehtiin seuraava toimenpide. Eläimet asennettiin kuvantamisalustoille ja kuhunkin alustaan lisättiin suolaliuosta. Vain satunnainen osajoukko eläimistä leikattiin. Kukin asennettu kärpänen asetettiin sitten pallomaiselle juoksumatolle, ja sen kävelykäyttäytyminen rekisteröitiin 30 minuutin ajan. Optinen virtaus rekisteröitiin edellä kuvatulla tavalla. Paikantamisen todennäköisyyden lisäämiseksi kärpäsen antenneihin suunnattiin 500 ms:n pulssi 100-prosenttista hiilidioksidia yhden minuutin pulssien väliajalla (0,05 ln min-1 massavirtaussäätimellä; Vögtlin Instruments, Sveitsi).
Infrapunalaser-antennistimulaatio
Vertaillaksemme Act88F:Rpr- ja kontrollieläinten välistä kävelykäyttäytymistä ärsytimme kärpäsen antenneja lähi-infrapunalaserilla 830 nm:n säteellä (Schäfter + Kirchhoff, Saksa). Nukutimme ensin 7-8 dpe:n naaraspuoliset eläimet 4 °C:ssa ja kiinnitimme ne kuvantamisalustoille. Sen jälkeen kärpäsiä akklimatisoitiin 10 minuutin ajan. Jokaista koetta varten eläin sai kymmenen 2 sekunnin laserstimulaatiopulssia (18,1 mW) oikeaan antenniinsa 60 sekunnin pulssivälein. Kontrolli- ja Act88F:Rpr-eläimiä testattiin vuorotellen, jotta vuorokausiajan vaikutukset käyttäytymisvertailuihin saatiin minimoitua.
Tilastot
Eläinkokeiden otoskoko valittiin seuraavasti: teimme vähintään kolme koetta havainnollistaaksemme populaatio- ja harvalukuisia neuraalisia nauhoituksia ja suoritimme yli kymmenen koetta ryhmää kohti, kun suoritimme tilastollisia vertailuja. Alhaisen signaali-kohinasuhteen fluoresenssisignaalien ennalta asetetut kriteerit johtivat kahden MDN-kokeen poistamiseen tietokokonaisuudestamme. Satunnaistamista tai sokeuttamista ei käytetty. Antennin laserstimulaation osalta tiedot eivät olleet normaalisti jakautuneita, joten Friedmanin ja Mann-Whitneyn U-testit suoritettiin. Vaihteluarviot esitetään keskiarvoina ja bootstrapped 95% luottamusväleinä.
Tietojen analysointi
Analysoimme kaikki tiedot käyttämällä mukautettuja Python-skriptejä. Koska tiedonhankintataajuus vaihteli optisen virtauksen, käyttäytymisvideografian ja 2-fotonikuvantamisen osalta, interpoloimme signaalit vastaamaan korkeimman taajuuden signaaleja. Tämän jälkeen optisen virtauksen tiedot tasoitettiin käyttämällä juoksevaa keskiarvoa (ikkuna = 200 ms) ja käännettiin sitten pyörimisiksi s-1 anterior-posterior-, mediaalis-lateraali- ja yaw-akseleille22. Jotta nämä mittaukset olisivat intuitiivisempia, pyörimisnopeudet s-1 muunnettiin sitten mm s-1:ksi (1 pyörimisnopeus s-1 = 31,42 mm s-1) anteriorisen-posteriorisen (vforward) ja mediaalisen-lateraalisen (vside) liikkeen osalta ja asteiksi s-1:ksi (1 pyörimisnopeus s-1 = 360° s-1) yaw-akselilla tapahtuvan liikkeen (vrotaatio-akselilla tapahtuvan liikkeen) osalta22.
Lokalisoinnin analyysi leikellyissä eläimissä (Täydentävä kuvio 2) suoritettiin seuraavasti. Vforward-optiikkavirtatiedot 20 leikatusta ja 20 ei-leikatusta kärpäsestä pienennettiin 1500 pisteeseen s-1 ja tasoitettiin käyttämällä juoksevaa keskiarvoa, jonka kesto oli 0,2 s. Eteenpäin/taaksepäin tai sivuttain kävelemisen prosenttiosuuden laskemiseksi määriteltiin empiirisesti kaksi kynnysarvoa, -0,31 mm s-1 ja +0,31 mm s-1, erottamaan toisistaan paikallaan seisominen ja eteenpäin (oikealle) tai taaksepäin (vasemmalle) käveleminen. Arvoja yli 0,31 mm s-1 pidettiin eteenpäin (oikealle) kävelyn hetkinä ja arvoja alle -0,31 mm s-1 pidettiin taaksepäin (vasemmalle) kävelyn hetkinä. Näiden kynnysarvojen väliset optisen virtauksen arvot katsottiin paikallaan seisomisen hetkiksi. Kävelyajan prosenttiosuus laskettiin niiden datapisteiden osuutena, joissa eläintä ei pidetty paikallaan seisovana. Vastaavasti 10,8 ja -10,8 asteen s-1 kynnysarvoja käytettiin määriteltäessä kääntymisen hetkiä. Jakso määriteltiin yhtäjaksoiseksi kävelyn tai kääntymisen jaksoksi.
Käyttäytymisen aikana saattoi tapahtua suuria kudosmuodonmuutoksia. Siksi suoritimme post-hoc pan-neuronaalisen kuvan rekisteröinnin (Kuva 2). Rekisteröimme kaikki kuvantamiskokeen ruudut yhteen referenssikuvaan. Koska deformaatioiden monimutkaisuutta ei voitu kuvata yksinkertaisilla parametrisilla liikemalleilla (esim. affiinisilla muunnoksilla), käytimme ei-parametrista, variationaalista lähestymistapaa, joka on suunniteltu mallintamaan mielivaltaisesti monimutkaisia deformaatioita. Laskimme liikekentän w referenssikuvan, jota merkitään Ir, ja ajanhetken t kuvan, jota merkitään It, välillä ratkaisemalla minimointiongelman
jossa D(w) on datan sovitustermi, toinen termi on regularisaatio, joka edistää w:n tasaisuutta rankaisemalla sen gradienttia ∇w41, Ω on diskreetti kuva-alue, ja parametri λ tasapainottaa näiden kahden termin osuudet.
GCaMP6s-kuvat ovat haaste liikkeen estimoinnille, koska neuraalinen aktiivisuus aiheuttaa suuria paikallisia intensiteettimuutoksia. Siksi käytimme ylimääräistä aktiivisuudesta riippumatonta fluorofooria, tdTomaattia, ja määrittelimme datatermin muodossa
Ensimmäinen termi mallintaa tavanomaista oletusta intensiteetin säilymisestä kunkin pikselin liikeradalla. Se määritellään seuraavasti:
jossa käytämme \(\ell _1\) normia saadaksemme osittaista robustisuutta intensiteettimuutoksille42. Yhtälön (2) toinen termi on Revaudin ja työtovereiden43 innoittama ominaisuuksien yhteensovittamisrajoitus, joka on kirjoitettu seuraavasti:
Yhtälöissä (2)-(4) Ir ja It ovat tdTomaattikanavasta. Funktion ϕ minimoiminen suosii sitä, että liikevektorit w(x) ovat lähellä ominaisuuksien vastaavuuksia m(x, Ir, It), jotka on laskettu harvasta relevanttien avainpisteiden joukosta. Saamme m:n Revaudin ja työtovereiden43 ehdottamalla piirteiden yhteensovittamisalgoritmilla, joka on erityisesti suunniteltu käsittelemään suuria kuvan muodonmuutoksia. Laskemme m:n käyttämällä tdTomato-kuvauskanavaa, jolloin vastaavuudet eivät myöskään ole herkkiä Ir:n ja It:n välisille intensiteettimuutoksille. Näin ollen estimointia ohjaavat luotettavat ominaisuuksien vastaavuudet. Parametri γ tasapainottaa yhtälön (2) kahta termiä.
Kunkin kokeen osalta optimoimme λ:n ja γ:n arvot käyttämällä ruudukkohakua VNC:n vaakasuuntaisten poikkileikkauskuvien rekisteröimiseksi (täydentävä kuva 4). Optimoinnin tavoitefunktiona käytimme ajallisen keskikuvan gradienttia44. Pienet λ:n arvot (eli λ < 1000) johtivat toisinaan artefakteihin rekisteröidyissä kuvissa. Nämä artefaktit liittyivät vektorikentän w(x) voimakkaaseen konvergenssiin (täydentävä kuva 4c). Siksi määrittelimme empiirisesti artefaktit pikseliryhmiksi, joiden \({\mathrm{div}}\,{\mathbf{w}}\left( {\mathbf{x}} \right) < – 1.2\) ja kardinaliteetti >20 (saimme samankaltaisia tuloksia kardinaliteetilla >5). Lopuksi valitsimme λ- ja γ-arvot sellaisiksi, joissa ei ollut artefakteja ja joissa keskiarvokuvan gradientti oli suurin. Esimerkkikuvat rekisteröimättömistä kuvista, muunnosvektorikentistä ja rekisteröidyistä kuvista kolmesta optimoidusta esimerkistä on esitetty lisäelokuvassa 5.
Ratkaisimme yhtälön (1) mukaisen optimointiongelman ADMM-algoritmilla (alternated direction method of multiplier)45. Otimme käyttöön kaksi jakomuuttujaa, jotka liittyvät vastaavasti regularisointi- ja ominaisuuksien yhteensovitustermiin. Algoritmin jokainen osaongelma ratkaistiin analyyttisesti. Käytimme osia käänteisongelmakirjastosta, joka on kuvattu ref. 46. Painotettuun mediaanisuodatukseen perustuvaa jälkikäsittelyä sovellettiin käyttäen menetelmää osoitteesta47.
Kuvassa 2 käyttäytymistä annotoitiin puoliautomaattisesti käyttäen mukautettua Python-moduulia. Tämän moduulin avulla käyttäjä voi valita kaksi kiinnostavaa aluetta (ROI) videon ensimmäisestä kuvasta. Ensimmäistä ROI-aluetta käytetään kävelyn havaitsemiseen, ja sen on sijaittava metathorakaalisten ja mesothorakaalisten jalkojen päällä. Toisen ROI-alueen tehtävänä on havaita eturintakehän jalkojen hoitaminen, ja se on sijoitettava kärpäsen eteen. Näiden alueiden liikkeen havaitsemiseksi peräkkäiset ruudut vähennetään. Tuloksena saadut differentiaalikuvat häivytetään mediaanilla (säde = 5 pikseliä) kohinan vähentämiseksi. Tämän sumeutetun kuvan perusteella sovelletaan kynnysarvoa, joka koskee nollasta poikkeavien pikseleiden lukumäärää kummassakin ROI:ssa, jotta voidaan poimia binääriset sekvenssit grooming- ja kävelyjaksoista. Huomattakoon, että kävelyn aikana havaitut prothorakaaliset jalkojen liikkeet jätetään huomiotta (eli grooming-luokitus on alisteinen kävelyluokitukselle). Tämän jälkeen käytettiin hystereesisuodatinta alipäästösuodattamaan binääriset käyttäytymissekvenssit ja poistamaan siirtymät, jotka tapahtuvat liian harvoissa kehyksissä ollakseen biologisesti uskottavia. Esimerkkejä ROI:ista ja käyttäytymismerkinnöistä on esitetty Supplementary Movie 6:ssa. Tätä käyttäytymistietoa käytettiin kuvassa 2, kuten Supplementary Movie 2:ssa on esitetty. Se annotoitiin käyttämällä seuraavia parametreja: kynnysarvo kävelylle = 400, kynnysarvo groomingille = 5, hystereesin pituus kävelylle = 8, hystereesin pituus groomingille = 10.
Kuvissa 2b, c käytimme lineaarista regressiota löytääksemme VNC: ssä alueet, jotka liittyvät joko kävelyyn tai groomingiin. Regressorit Xw ja Xg (kävelyä ja groomingia varten) muodostettiin kahdesta käyttäytymisjaksosta, Sw ja Sg, käyttäen yhtälöä (5) konvoluutiolla eksponentiaalisesti laskevan kalsiumsignaalin impulssivasteen (CIR) kanssa, joka on johdettu GCaMP6s:lle mitatusta aikavakioidusta aikavakioidusta (t½ = 1,1448 s)19.
Kohdefunktiot olivat pikselikohtaisia ∆F/F-jälkiä, missä ∆F = Ft – F. Ft on fluoresenssi ajanhetkellä t. F on perusviivan fluoresenssisignaali, joka mitattiin pikselin keskiarvona kymmenestä ensimmäisestä peräkkäisestä GCaMP6s-kuvasta, joissa ei havaittu lainkaan solujen aktiivisuutta (ts, minimaalinen ja muuttumaton GCaMP6s-fluoresenssi).
Regressoripainot laskettiin yhtälön (6) avulla.
jossa y on pikseleittäin ∆F/F-jälki.
Kuvassa 2b, c esitetään lämpökartat regressoripainoista, ww kävelylle ja wg groomingille, jotka on normalisoitu niiden maksimiin. ROI 1 valittiin lämpökartan alueeksi, jolla on suuri paino groomingille mutta pieni paino kävelylle. ROI 2 valittiin alueeksi, jossa ww:n arvo oli korkein. Kukin ROI käsittää alueen, jonka säde on 15 pikseliä.
Prosessin tunnistamiseksi harva neuraalinen kuvantamistieto (kuvat 3-5), ROI:t valittiin ensin käyttämällä mukautettuja Python-skriptejä, jotka riippuivat OpenCV- ja Numpy-kirjastoista. Tätä varten valittiin viitekehys, jolle ohjelmisto tunnisti kaikki mahdolliset ROI:t. Tätä varten GCaMP6s-kuva tasoitettiin taustakohinan vähentämiseksi, minkä jälkeen kuvaan sovellettiin Otsu-suodattimen kynnysarvoa. Tämän jälkeen kaikkiin kuvassa havaittuihin kohteisiin sovellettiin eroosiokerrointa. Kaikkien havaittujen kohteiden ääriviivat esitettiin sitten käyttäjälle manuaalista valintaa varten. Kun nämä viite-ROI:t oli valittu vasemmalle ja oikealle neuronille, käytimme ristiinkorrelaatioon perustuvaa kuvan rekisteröintialgoritmia48 tunnistamaan todennäköisimmät vasen ja oikea ROI kullekin kuvakehykselle niiden perusteella, jotka oli valittu manuaalisesti referenssikehyksestä. Toista skriptiä käytettiin automaattisesti valittujen ROI:iden manuaaliseen tarkistamiseen ja, jos ne olivat virheellisiä, kaikkien kehyksessä olevien mahdollisten ROI:iden näyttämiseen manuaalista valintaa varten. Jos eroosioarvot antoivat epämuodostuneita ROI:ita, toista skriptiä käytettiin manuaalisesti sijoittamaan mielivaltaisen orientaation omaavia elliptisiä ROI:ita mihin tahansa kehykseen. Lopuksi binäärisiä ROI-kuvia käytettiin kuvamaskina keskimääräisten fluoresenssisignaalien erottamiseksi alkuperäisistä GCaMP6s- tai tdTomato-kuvauksista. Nämä signaalit ilmoitettiin %∆R/R:nä, kuten ref. 49, jotta voitiin vähentää liikkeen vaikutusta mittauksiimme. Koska ärsykkeitä ei ollut, perusviiva R laskettiin GCaMP6s / tdTomato -suhteen vähimmäissuhteena 2,5 s:n binäärin sisällä.
Aktiivisuuden ohimenevien nousujen havaitsemiseksi kehitimme algoritmin, joka perustuu osittain ref. 50. Määritimme ensin, milloin %∆R/R-signaalin ensimmäinen derivaatta ylitti kynnysarvon, joka määritettiin tarkastelemalla kaikkia tietyn neuroniluokan (MDN, MAN tai A1) derivaatta-arvoja. Perustelimme, että kynnysarvojen pitäisi olla tyypillisiä ja mahdollisesti erilaisia kullekin neuronityypille, koska fluoresenssidynamiikka liittyy luontaisiin fysiologisiin ominaisuuksiin, jotka voivat vaihdella eri neuroniluokissa mutta eivät yhden luokan kokeissa. Asetimme kynnysarvoksi 97,5. persentiilin MDN- ja dMAN-neuroneille ja 90. persentiilin A1-neuroneille. A1-neuroneille valittiin alempi kynnysarvo, koska A1-jäljissä havaittiin paljon enemmän fluoresenssitransientteja. Nämä transientit olisivat jääneet huomaamatta, jos olisi käytetty 97,5. prosenttipisteen kynnysarvoa. Fluoresenssin lisääntymisen alkamisen tunnistamiseksi etsittiin lähin edeltävä aikapiste, jossa derivaatta ylitti nollan. Tätä nollan ylitystä pidetään tunnistettuun fluoresenssin nousuun liittyvän ”tapahtuman” ajankohtana. Lähellä toisiaan havaitut tapahtumat, joiden välillä ei ollut derivaatan nollapisteen ylitystä, tiivistettiin yhdeksi tapahtumaksi, joka liittyi ensimmäiseen aikapisteeseen. Eläintä kohti tehtiin ~10 erillistä koetta. Kunkin kokeen ensimmäisen ja viimeisen 10 s: n tapahtumia ei otettu huomioon, koska tietojen esittämisikkuna käsitti 10 s ennen ja 10 s kunkin tapahtuman jälkeen.
Koska vasemman ja oikean MDN- ja dMAN-aktiviteetit varioituivat voimakkaasti (Täydentävä kuva 5), tapahtumien havaitsemiseksi suoritettiin lisävaihe: jos tapahtumia havaittiin sekä vasemmassa että oikeassa neuronissa 2 s: n sisällä, molemmat tapahtumat säilytettiin; muussa tapauksessa hermosolun A osalta tunnistettu tapahtuma (esim, vasemmalle MDN:lle) mutta ei neuronille B (esim. oikealle MDN:lle), lisättiin myös neuroni B:n tapahtumakirjastoon.
Vasemman ja oikean A1:n aktiviteetit eivät sitä vastoin kovarioineet voimakkaasti. Siksi tapahtumat liittyivät yhteen eikä toiseen neuroniin. Tämän saavuttamiseksi, jos tapahtuma havaittiin sekä vasemman että oikean A1-neuronin osalta 0.25 s:n aikaikkunassa, kumpaakaan tapahtumaa ei käytetty analyysiin.
%∆R/R- ja optisen virtauksen jäljet, jotka oli liitetty kuhunkin tapahtumaan, linjattiin asettamalla tapahtuman aikapisteet 0 s:iin. Tämän jälkeen laskimme näiden linjattujen jälkien keskiarvot ja bootstrapped 95% -luottamusarvovälit Pythonin Seaborn-kirjastoa käyttäen. Optisen virtauksen ja %∆R/R-mittausten näytteenotto pienennettiin 500 arvoon s-1 tätä analyysia varten. Selkeyden lisäämiseksi %∆R/R-jäljet vähennettiin perusviivalla, jotta ne olisivat nolla tapahtumahetkellä yhteenvetopaneeleissa (kuvat 3d, 4d ja 5d, e). Kontrolli, sekoitetut tiedot (harmaat jäljet) laskettiin osoittamalla satunnaisia aikapisteitä todellisten, tunnistettujen tapahtumien tilalle. Näitä satunnaisia aikapisteitä käsiteltiin todellisina tapahtumina, ja niiden keskiarvo ja bootstrapped 95 prosentin luottamusvälit laskettiin ja piirrettiin vertailua varten.
Kovarianssianalyysi (Täydentävä kuva 5) suoritettiin käyttämällä mukautettua Python-skriptiä, joka riippui Matplotlib- ja Numpy-kirjastoista. Hajontakuvioita laskettiin vasemman ja oikean neuronin %∆R/R-arvojen vertaamiseksi kaikista kokeista kunkin kärpäsen osalta erikseen. Pearsonin r-arvot ilmoitetaan keskiarvona ± keskihajonta.
Tapahtumiin liittyvät käyttäytymiset (Supplementary Movies 8, 10, 12 ja 13) valittiin manuaalisesti automaattisesti havaituista tapahtumista edellä kuvatulla tavalla. Tapahtumat valittiin dMAN-tapahtumien osalta niiden joukosta, jotka maksimoivat pallon anterior-posterior-kierron eron 1 s ennen tapahtumaa ja 2 s tapahtuman jälkeen. MDN:n osalta tapahtumat valittiin niiden tapahtumien joukosta, jotka minimoivat pallon anteriorisen ja posteriorisen kierron 2 s:n ajan tapahtuman jälkeen. A1-neuronien osalta tapahtumat valittiin niiden tapahtumien joukosta, jotka maksimoivat keskimääräiset yaw-pallon pyörähdykset (positiiviset vasemman A1-neuronin esimerkeissä ja negatiiviset oikean A1-neuronin esimerkeissä) enintään 2 s tapahtumien jälkeen.
Lisäkuvassa 8 vasteet lähi-infrapunaiseen laserstimulaatioon keskiarvoistettiin kunkin eläimen 10 kokeesta. Optinen virtaus downsamplattiin 500 arvoihin s-1. Optisen virtauksen jälkien keskiarvot ja 95 prosentin bootstrapped-luottamusvälit mitattiin ja piirrettiin Python Seaborn -kirjaston avulla. Python Scipy -kirjastoa käytettiin Friedmanin ja Mann-Whitneyn U-testien suorittamiseen.