Laajamittaisen 16S rDNA PCR:n indikaatiot
Lajamittaisella 16S rDNA PCR:llä voidaan havaita sekä elinkelpoisia että elinkelvottomia bakteereja qPCR:n tavoin. Se on kliinisesti käyttökelpoinen myös silloin, kun muut tekniikat antavat negatiivisen tuloksen, esimerkiksi viljelynegatiivisessa endokardiitissa, septisessä artriitissa, aivokalvontulehduksessa tai pitkäkestoisissa infektioissa.8 11 Tunnistetut bakteerit ovat usein epätavallisia, harvinaisia, vaikeasti viljeltäviä tai bakteereja, joille ei ole saatavilla spesifistä PCR:ää.8 9 Esimerkkeinä voidaan mainita Helicobacter sp:n tunnistaminen osteomyeliitin tai Neisseria meningitidis -bakteerin tunnistaminen septisen niveltulehduksen odottamattomaksi aiheuttajaksi 16S rDNA:n laaja-alaisella PCR:llä sen jälkeen, kun muilla mikrobidiagnostiikkatekniikoilla saatiin negatiivisia tuloksia.12 13 13
Lajeja voidaan myös erottaa toisistaan: Ureaplasma spp koostuu kahdesta bakteerikannasta, Ureaplasma parvum ja Ureaplasma urealyticum, joita ei voida erottaa toisistaan viljelyssä, ja joiden kummankin epäillään aiheuttavan erilaista patologiaa vastasyntyneillä.7 14 15 Laajamittainen 16S rDNA PCR, jota seuraa sekvensointi, on mahdollistanut molempien lajien erottamisen ja tunnistamisen, mikä on auttanut lajikohtaisen patogeenisuuden tutkimisessa.8 16
Lisäksi laajamittaisella 16S rDNA PCR:llä voidaan tunnistaa aiemmin tuntemattomia bakteereja. Laajamittainen 16S rDNA PCR mahdollisti Bartonella henselae- ja Tropheryma whippelii -bakteerien tunnistamisen kissan raapimisen taudin ja Whipplen taudin taustalla oleviksi taudinaiheuttajiksi.17 18 18
Laajamittaisen 16S rDNA PCR:n laaja-alaisuus tekee siitä kuitenkin alttiin kontaminaatiolle. Kaikki näytteessä oleva bakteeri-DNA monistetaan, mukaan lukien reagensseissa väistämättä oleva DNA, mikä tarkoittaa, että vähäistä ympäristökontaminaatiota on mahdotonta poistaa kokonaan. Kun lämpösyklien määrä on suuri, tämä matala taustakontaminaation DNA monistuu ja antaa väärän positiivisen tuloksen. Tämän riskin vähentämiseksi sekvensointi on suoritettava, jotta voidaan erottaa aito patogeeni ja kontaminaatiot (usein veden välityksellä leviävät bakteerit, jotka eivät todennäköisesti aiheuta tautia). Tavanomaisilla sekvensointitekniikoilla voidaan tunnistaa vain hallitsevin DNA-sekvenssi, mikä tarkoittaa, että näytteissä, joissa esiintyy useampaa kuin yhtä bakteerilajia (kuten ulosteessa), tuloksia ei voida tulkita. Tämä tarkoittaa, että laajamittainen 16S rDNA PCR, jossa käytetään standardisekvensointia, ei ole käyttökelpoinen näytteille, jotka on otettu ei-steriileistä paikoista.
Kontaminaation aiheuttaman riskin pienentämiseksi entisestään lämpösyklien määrää on vähennetty spesifisiin qPCR-menetelmiin verrattuna, mutta samalla herkkyys vähenee.19 Tämä tarkoittaa sitä, että laajamittainen 16S rDNA PCR on aina vähemmän herkkä kuin hyvin suunniteltu spesifinen qPCR-menetelmä, ja sen herkkyys on luokkaa 1 – 2 login verran. Viimeinen haittapuoli on se, että nämä menetelmät voivat rajoittua tutkimuslaboratorioihin tai erikoislaboratorioihin, mikä tarkoittaa, että näytteet voidaan joutua lähettämään muualle, mikä lisää läpimenoaikaa.16 Viljelymenetelmien, qPCR:n ja 16S rDNA:n laajamittaisen PCR:n tärkeimpien hyötyjen ja haittojen vertailu esitetään taulukossa 1, ja kuvassa 1C on esitetty virtauskaavio epäiltyjen bakteerien aiheuttamien steriilien infektioiden ehdotetuista tutkimuksista, jotka sisältävät sekä qPCR:n että 16S rDNA:n laajamittaisen PCR:n.
Yhteenvetona voidaan todeta, että 16S rDNA:n laajamittainen PCR on tärkeä lisä mikrobiologiseen diagnostiikkaan toisena vaihtoehtona silloin, kun steriilin paikan infektiota epäillään vahvasti, mutta viljely ja qPCR todennäköisimpien taudinaiheuttajien osalta ovat osoittautuneet negatiivisiksi. Bakteerien DNA-kontaminaation havaitsemisriskin vuoksi PCR-syklejä tehdään vähemmän kuin qPCR:ssä, mikä johtaa vähemmän herkkään määritykseen, joten qPCR:ää olisi käytettävä ensin (kuva 1C). Tutkimuksessa 16S rDNA PCR:ää käytetään jatkossakin uusien bakteerilajien tunnistamiseen, lajispesifisen patogeenisuuden luonnehtimiseen ja kultaisena standardimäärityksenä, johon verrataan uusia määrityksiä arvioitaessa. Sitä käytetään myös yhdessä huipputekniikoiden, kuten seuraavan sukupolven sekvensoinnin, kanssa. Tätä käytetään kuvaamaan monimutkaisia mikrobipopulaatioita suolistossa, ulosteessa, emättimessä, istukassa, keuhkoissa ja ympäristöolosuhteissa.20 Kun 16S rDNA:n PCR:ään perustuva seuraavan sukupolven sekvensointi tulee edullisemmaksi ja laajemmin saataville, näillä tekniikoilla on mahdollisuus mahdollistaa räätälöity terapia, kun ymmärryksemme mikrobiyhteisömme monimutkaisesta vuorovaikutuksesta lisääntyy.21 Esimerkiksi suoliston mikrobiyhteisöjen laajamittaisella 16S rDNA PCR:llä on havaittu selviä muutoksia esimerkiksi HIV:n, vastasyntyneiden ennenaikaisen synnytyksen jälkeisen synnytyksen ja aliravitsemuksen kaltaisissa tiloissa.22-24 Kun tutkimme näissä erilaisissa tiloissa paljastuneita mahdollisia terapeuttisia keinoja, on todennäköistä, että laajamittainen 16S rDNA PCR tulee olemaan jatkotutkimuksen kulmakivi.