AMDock: monipuolinen graafinen työkalu molekyylidockauksen avuksi Autodock Vinalla ja Autodock4:llä | Biology Direct

Molekyylidockauksesta on tullut tehokas työkalu johtolankojen löytämiseen ja optimointiin. Viimeisten kolmen vuosikymmenen aikana on kehitetty suuri määrä telakointiohjelmia, jotka perustuvat erilaisiin hakualgoritmeihin ja pisteytysfunktioihin. Jotta näistä telakointiohjelmista saataisiin käyttäjäystävällisempiä erityisesti aloittelijoille, on kehitetty erilaisia graafisia käyttöliittymiä (GUI), jotka auttavat molekyylijärjestelmien valmistelussa, laskelmien suorittamisessa ja/tai tulosten analysoinnissa. Esimerkkejä saatavilla olevista graafisista käyttöliittymistä (jotka on kehitetty enimmäkseen AutoDock- ja/tai Autodock Vina -ohjelmia varten) ovat AutoDock Tools (ADT), joka on integroitu PMV-grafiikkapakettiin , BDT , DOVIS , VSDocker , AUDocker LE , WinDock , DockoMatic , PyMOL AutoDock -lisäosa (PyMOL/AutoDock) , PyRx , MOLA , DockingApp ja JADOPPT .

Esittelemme tässä uuden monialustatyökalun, AMDockin (Assisted Molecular Docking), jonka tärkein etu edeltäjiinsä verrattuna on useiden arvokkaiden ulkoisten työkalujen integrointi yksinkertaiseen ja intuitiiviseen graafiseen käyttöliittymään, joka opastaa käyttäjiä vakiintuneiden telakointiprotokollien mukaisesti – joko Autodock4:n tai AutoDock Vinan avulla – systeemien valmistelusta tulosten analysointiin.

Toiminnallisuudet ja työnkulku

AMDock integroi Autodock Vinan ja Autodock4:n toiminnallisuudet, ADT-skriptit, AutoLigand , Open Babel , PDB2PQR ja PyMOL . Proteiineille, jotka sisältävät sinkki-ionin aktiivisessa keskuksessa, AMDockissa on mahdollisuus käyttää erityisesti räätälöityjä Autodock4Zn-parametreja. AMDock on koodattu Python 2.7:llä, ja se on saatavilla Windows- ja Linux-käyttöjärjestelmille. Windowsissa se on pakattu yhdessä kaikkien integroitujen työkalujen kanssa, joten lisäohjelmiston asentamista ei tarvita. Linuxissa on asennettava vain Open Babel ja PyMOL (molemmat työkalut sisältyvät useimpiin suosittuihin Linux-tietovarastoihin).

AMDockin pääikkunassa on viisi välilehteä: 1) Home, 2) Docking Options, 3) Results Analysis, 4) Configuration ja 5) Info. Alla on esitetty yhteenveto AMDockin toiminnallisuuksista ja työnkulusta (kuva 1), jota käsitellään sen jälkeen tarkemmin.

Välilehdellä ”Home” (Koti) käyttäjä voi valita telakointimoottorin: Autodock Vina tai Autodock4, ja lisäksi on mahdollista käyttää Autodock4Zn-parametreja. Tämän jälkeen käyttäjä ohjataan automaattisesti ”Docking Options”-välilehdelle, joka sisältää neljä paneelia, jotka ohjaavat telakointisimulaation peräkkäistä valmistelua.

Syöttötiedostot AMDockille

Vähintäänkin tarvitaan ligandi- ja reseptorimolekyylien kartesiankoordinaatit, jotka voidaan toimittaa useissa yleisissä rakenneformaateissa, esimerkiksi PDB tai PDBQT proteiinille ja PDB, PDBQT tai Mol2 ligandille. Jos proteiinin koordinaatit tulevat yhteen sidotun ligandin kanssa, jälkimmäisen koordinaatit tallennetaan ja niitä voidaan käyttää jälkikäteen hakuavaruuden määrittelyyn.

Ohjelma toimii noudattamalla kolmea päävaihetta:

1-
Docking-syöttötiedostojen valmistelu: Ensimmäiseksi käyttäjä voi asettaa pH-arvon sekä ligandin (valinnainen, oletusarvo 7,4) protonoitumiselle käyttäen Open Babelia että proteiinille (oletusarvo: 7,4) käyttäen PDB2PQR:ää. Käytettävissä on kaksi erilaista telakointivaihtoehtoa: a) ”yksinkertainen telakointi” yksittäisen proteiini-ligandi-kompleksin sitoutumistavan ennustamiseen ja b) ”off-target-telakointi” ligandin sitoutumisasentojen ennustamiseen kahteen eri reseptoriin, eli kohde- ja off-target-reseptoriin. Tämän välilehden ”Scoring”-vaihtoehto mahdollistaa jo olemassa olevan proteiini-ligandi-kompleksin pisteyttämisen käyttämällä Autodock Vina-, Autodock4- tai Autodock4Zn-toimintoja. Kun telakointi- tai pisteytysprotokolla on valittu, syötetiedostot valmistellaan ADT-skriptien avulla.
2-
Hakuavaruuden määrittäminen: Laatikon keskipisteen ja mittojen määrittelyyn voidaan käyttää neljää eri lähestymistapaa: a) ”Automaattinen” – ohjelma käyttää AutoLigand-ohjelmaa mahdollisten sitoutumiskohtien ennustamiseen ja sen jälkeen optimaaliset mitat omaava laatikko keskitetään kunkin AutoLigand-objektin,alaviite 1, päälle jokaisessa ennustetussa sitoutumiskohdassa. b) ”Center on Residue(s)” – AutoLigand-ohjelmaa käytetään tuottamaan objekti, jonka tilavuus vastaa ligandikokoa käyttäen referenssinä valittujen jäännösten geometrista keskipistettä. Tämän jälkeen luodun objektin keskelle asetetaan laatikko, jolla on optimaaliset mitat. c) ”Center on Hetero” – laatikko asetetaan olemassa olevan ligandin geometriseen keskipisteeseen (jos reseptori annettiin kompleksina ligandin kanssa), ja d) ”Box” – käyttäjä määrittelee laatikon keskipisteen ja mitat. Millä tahansa näistä menetelmistä luotu laatikko voidaan visualisoida PyMOL:ssa ja sitä voidaan helposti muokata käyttäjän tarpeen mukaan PyMOL:n valikkoikkunaan upotetulla uudella AMDock-lisäosalla (mukautettu osoitteesta ).
3-
Docking-simulaatioiden suorittaminen ja tulosten analysointi: Kun molekyylien telakointilaskelmat on suoritettu (käynnistetty napsauttamalla ”Suorita”-painiketta), käyttäjä siirtyy automaattisesti ”Tulosten analysointi”-välilehdelle, jossa luetellaan affiniteetti, arvioidut Ki -arvot ja liganditehokkuudet eri sitoutumisasennoille.

Arvioitu Ki on erittäin hyödyllinen arvo, koska se liittyy affiniteettiin verrattuna enemmän yleensä mitattuihin kokeellisiin parametreihin. Ligandin tehokkuus (LE) on toisaalta tärkeä informatiivinen parametri valittaessa johtavaa yhdistettä . Tässä LE lasketaan seuraavan yhtälön avulla:

$$$ LE=\frac{-\varDelta G}{HA}, $$$

(1)

jossa ΔG on sitoutumisen vapaa energia tai laskettu pisteet-arvo ja HA on ligandin raskaiden (muiden kuin vety-) atomien lukumäärä. Yhdisteet, joiden LE > 0.3, korostetaan potentiaalisina johtavina yhdisteinä .

”Show in PyMOL”-painike käynnistää PyMOL:n mukautetulla visualisoinnilla reseptorin ja valitun poseerauksen välisestä kompleksista (oletuksena valitaan alhaisimman energian omaava ligandiposeeraus). Koko prosessin aikana saadut tiedot tallennetaan tiedostoon (*.amdock), jota voidaan käyttää tulosten tutkimiseen milloin tahansa myöhemmin.

Erilaiset telakointiparametrit voidaan asettaa ”Configuration”-välilehdellä, kun taas ”Info”-välilehdellä, pääsee käsiksi kätevään dokumentaatioon, mukaan lukien käyttöopas ja viitteet.

Visualisointi

AMDock luottaa PyMOL:iin visualisoinnissa kahdessa eri vaiheessa: 1) ruudukkolaatikon sijainnin ja mittojen (hakuavaruuden) asettaminen ja 2) telakointitulosten analysointi. PyMOL on monipuolinen ja käyttäjäystävällinen molekyylianalyysiohjelma, jonka avulla voidaan lisäksi luoda korkealaatuisia kuvia julkaisemista varten. Olemme koodanneet AMDock-ohjelmalla useita ennalta määrättyjä PyMOL-esityksiä näitä kahta vaihetta varten ja valinneet kussakin tapauksessa optimaalisena pitämämme visuaalisen ulkoasun ja tiedot. Käyttäjä voi muuttaa näitä ennalta määrättyjä esityksiä PyMOLissa.

Hakuavaruus

Esiasetetut esitykset (monimutkaisuuden mukaan alenevassa järjestyksessä visualisoinnin sisällön elementtien lukumäärän mukaan) ovat seuraavat: 1) Laatikko – yksinkertainen esitys, jossa tutkittava proteiini näkyy sarjakuvana yhdessä laatikon kanssa, jossa on käyttäjän määrittelemät spesifikaatiot (kuva 2a); 2-Centered on Hetero – sisältää reseptoriproteiinin (sarjakuva) ja laatikon, jonka optimaalinen koko on keskitetty valittuun aiempaan ligandiin (tikkuja) (kuva 2b); 3-Centered on Residue(s) – esitys, jonka avulla käyttäjä voi yksilöidä hakuavaruuden määrittelyä varten valitut jäännökset. Proteiini esitetään sarjakuvana, valitut jäännökset tikkuina ja AutoLigand-objekti pisteinä. Laskettu laatikko näytetään myös, jotta käyttäjä voi helposti tarkistaa ja säätää (tarvittaessa) sen sijainnin ja mitat (kuva 2c). 4-Automaatti – Tässä tarkoituksenamme oli luoda yksinkertaistettu esitys, jossa näytetään kaikki AutoLigandin ennustamat sitoutumiskohdat. Proteiini on piirroskuvana, kukin AutoLigand-objekti on esitetty tikkuina, joita ympäröi sen naapurijäännöksistä rakennettu pinta. Koska telakointisimulaatiot on tarkoitus suorittaa jokaiselle AutoLigandin ennustamalle paikalle, jokaiselle paikalle luodaan laatikko, mutta se näytetään vain käyttäjän valitsemalle paikalle (kuva 2d). Kuten edellä mainittiin, missä tahansa näistä vaihtoehdoista laatikon keskipistettä ja kokoa voidaan helposti muuttaa PyMOL:iin toteutetulla AMDock-lisäosalla.

Tulosten analysointi

Proteiini on esitetty sarjakuvana. Kukin ligandipositio on piirretty tikuilla ja sen polaariset kontaktit proteiinin kanssa on esitetty katkoviivoilla. Samanlainen visualisointi on mahdollista myös molemmille proteiineille, jos valittiin ”Off-Target Docking” -menettely (kuva 3c). Tämä mahdollistaa ligandien poseerausten samanaikaisen vertailun sekä kohde- että off-target-proteiinien osalta.

Tapaustutkimus: SAR405:n sitoutumisen selektiivisyys – PI3Kγ vs. Vps34

Fosfatidyyliinositoli-3-kinaasi (PI3K) on entsyymi, joka osallistuu kasvuun, proliferaatioon, liikkuvuuteen, eloonjäämiseen ja solunsisäiseen liikenteeseen . PI3K on myös lupaava syöpäkohde, ja useita sen estäjiä on jo kliinisessä vaiheessa. Muutamat näistä estäjistä ovat parhaillaan vaiheen III kliinisissä tutkimuksissa, ja yksi niistä, alpelisibi, sai hiljattain (toukokuussa 2019) FDA:n hyväksynnän metastaattisen rintasyövän hoitoon.

PI3K:lla on useita isoformeja, jotka on ryhmitelty kolmeen eri luokkaan. Luokkaan I kuuluu neljä erilaista isoformia (α, β, γ ja δ), kun taas luokkaan III kuuluu vain yksi proteiini, nimeltään Vps34 . Sekvenssi- ja rakenteellisten yhtäläisyyksien vuoksi jotkin inhibiittorit voivat sitoa eri isoformeja, kun taas useat muut inhibiittorit on suunniteltu olemaan isoformispesifisiä. Tutkimusryhmämme keskittyy tällä hetkellä sellaisten PI3K:n estäjien tunnistamiseen, jotka kykenevät estämään PI3K:n ortologeja, joita esiintyy erilaisissa patogeenisissä mikro-organismeissa, jotka ilmentävät vain esi-isomuotoa Vps34. Tähän tarkoitukseen AMDock on arvokas työkalu, erityisesti sen ”Off-Target Docking” -vaihtoehto. Tässä demonstroidaan sen käyttöä harjoituksella, joka muistuttaa omaa tutkimustyötämme.

Sar405 on erittäin spesifinen Vps34:n estäjä (IC50 = 1,2 nM), kun taas sen IC50 muille isomuodoille on > 104 nM . Kiderakenne SAR405:stä kompleksissa ihmisen Vps34:n kanssa on saatavilla Protein Data Bankissa (PDB-koodi: 4oys). Tässä käytämme ihmisen Vps34:ää ”kohde”-reseptorina, kun taas PI3K gamma -isomuotoa (PDB: 3apf) käytetään ”ei-kohde”-reseptorina. Molemmat rakenteet sisältävät sidotun ligandin aktiivisessa keskuksessa, mikä on kätevää ruudukkolaatikon luomista varten. Ensimmäisessä vaiheessa valitaan telakointiohjelma (Autodock Vina) ja sen jälkeen luodaan projektikansio tietokoneen kiintolevylle. Kun molemmat proteiinirakenteet on ladattu, hyödynnämme niiden sekvenssien samankaltaisuutta ja käytämme käytettävissä olevaa mahdollisuutta niiden rakenteiden kohdistamiseen ja päällekkäin asettamiseen PyMOL-ohjelmalla, mikä mahdollistaa yhteisen hakuavaruuden määrittelyn ja helpottaa telakointitulosten myöhempää analysointia. Seuraavaksi syötetiedostot valmistellaan automaattisesti, mikä sisältää titrattavissa olevien jäännösten protonoinnin, ei-polaaristen hydrogeenien yhdistämisen ja ionien/veden poistamisen. Laatikon keskipiste määritellään sidottujen ligandien geometrisen keskipisteen perusteella (kuva 3a), kun taas laatikon koko määritellään telakoitavan ligandin , eli tässä tapauksessa SAR405-inhibiittorin, kiertosäteen perusteella. Alkuperäinen ligandin konformaatio (sen vääntökulmat) satunnaistettiin ADT:n avulla.

Prosessin päätyttyä tulokset osoittavat, että SAR405 on odotetusti selektiivisempi Vps34:lle (- 9,2 kcal/mol) kuin Pi3Kγ:lle (- 7,3 kcal/mol) (kuva 3b). SAR405:n ennustettu sitoutumisasento Vps34:ssä on lähellä kristalligeometriaa (rmsd = 1,9 Å kaikkien ligandiatomien osalta, rmsd = 0,5 Å rengasytimen osalta). Myös tämän kompleksin ennustettu ki-arvo on nanomolaarisella alueella, mikä vastaa kokeellista arvoa. Toisaalta Pi3Kγ-SAR405-kompleksille ennustetaan paljon korkeampi Ki -arvo, ja ennustettu sitoutumisasento poikkeaa merkittävästi kiteellisestä rakenteesta (rmsd = 4,7), kuten kuvasta 3c käy ilmi, mikä saattaa selittää AutoDock Vinan ennustaman heikon affiniteettiarvon. Tämä tutkimustapaus on sisällytetty opetusohjelmana käyttöoppaaseen, joka on AMDockin asennuskansiossa, ja Githubissa olevaan wikiin (https://github.com/Valdes-Tresanco-MS/AMDock-win/wiki/4.3-Off-target-docking).

Keskustelu

AMDock tarjoaa uudenlaisen, helppokäyttöisen ja monipuolisen käyttöliittymän, jonka avulla voidaan työskennellä kahden molekyylisen telakointimoottorin, Autodock4:n ja Autodock Vinan, kanssa, joilla on erilaiset toiminnot ja ominaisuudet. AMDockin pitäisi olla erittäin hyödyllinen tutkijoille, joilla on vain vähän kokemusta telakointiohjelmien kanssa työskentelystä, koska aiempaa tietoa näiden ohjelmien erityisestä toiminnasta ei tarvita. AMDock-ympäristössä on kolme erilaista työnkulkua (yksinkertainen telakointi, off-target telakointi ja pisteytys). Mielestämme off-target-docking-menettely on erityisen hyödyllinen ligandien selektiivisyystutkimusten tekemisessä, mikä on kriittinen vaihe lääkesuunnitteluprosessissa.

Syöttötiedostojen valmistelu asianmukaisella ja johdonmukaisella tavalla sekä hakuavaruuden oikea määrittely ovat kriittisiä asioita molekyylidocking-tutkimuksia tehtäessä. AMDockiin on integroitu useita ulkoisia ohjelmia/skriptejä, joiden avulla syöttötiedostot voidaan valmistella mahdollisimman pienellä vaivalla ja samalla pitää prosessi hallinnassa. AMDock käyttää OpenBabelia ja PDB2PQR:ää ligandin ja reseptorin protonointiin, kun taas muut johdannossa mainitut graafiset ohjelmat käyttävät ADT:tä sekä reseptorin että ligandin protonointiin (lukuun ottamatta DockingAppia, joka käyttää myös OpenBabelia ligandin protonointiin).

Hakuavaruuden määrittelemiseksi AMDock tarjoaa useita vaihtoehtoja ruudukkolaatikon sijainnin asettamiseksi eri skenaarioissa, kun taas syöttöligandia käytetään oletusarvoisesti laatikon optimaalisten mittojen määrittämiseen, mikä vähentää laskentakustannuksia optimoidessaan telakointiprosessia . Tältä osin vain ADT ja PyMOL/AutoDock-lisäosa tarjoavat joitakin rajoitettuja vaihtoehtoja käyttäjän määrittelemän hakuavaruuden lisäksi, mutta joka tapauksessa käyttäjän on määriteltävä laatikon koko. Joissakin näistä käyttöliittymistä, kuten DockingAppissa, hakuavaruus kattaa koko reseptorin, mikä aiheuttaa ylimääräisiä laskentakustannuksia ja mahdollisesti heikentää simulaatioiden tarkkuutta. Muissa graafisissa käyttöliittymissä käyttäjän on käytettävä ulkoista sovellusta, kuten ADT:tä, laatikon parametrien määrittämiseen.

Vaihtoehto ”Centered on Residue(s)” on suositeltavampi, kun sitoutumiskohdan jäännökset ovat tiedossa. Tällä vaihtoehdolla valittujen jäännösten geometriseen keskipisteeseen sijoitettu objekti luodaan AutoLigandilla proteiinin pinnalle. Tämä menettely optimoi sekä hakuavaruuden sijainnin että koon. Jos laatikko keskitettäisiin sen sijaan valittujen jäännösten geometriseen keskipisteeseen, merkittävä osa siitä olisi todennäköisesti upotettu proteiiniin, mikä edellyttäisi suurempaa kokoa tarvittavan näytteenottotilan kattamiseksi (kuva 4). ”Centered on Hetero” -vaihtoehto on hyödyllinen redocking-tutkimuksissa komplekseilla, joilla on kiteytetyt rakenteet, tai tutkittaessa ligandeja, joilla on samanlaiset sitoutumistavat (kuva 2b). Vaihtoehto ”Automaattinen” on puolestaan toivottava, kun sitoutumiskohtaa koskevia tietoja ei ole saatavilla. Tällöin jokaiselle AutoLigandin ennustamalle sitoutumiskohdalle suoritetaan itsenäinen telakointiajo (kuva 2d). Tällä tavoin AutoLigand-luokitusmenetelmästä saadut tiedot yhdistetään telakointimoottorin antamiin tietoihin ilman, että tehdään mielivaltainen valinta yhdestä ennustetusta paikasta. Tämä prosessi tapahtuu automaattisesti, ja kunkin ennustetun sitoutumiskohdan tulokset voidaan visualisoida PyMOL-ohjelmassa. Kaiken kaikkiaan laatikon määrittelyyn ja visualisointiin liittyy minimaalinen työmäärä, ja sitä voidaan aina muuttaa, mikä on etu paitsi aloittelevalle käyttäjälle myös asiantuntijoille.

On syytä huomata, että standardoimme laatikon koon angströmeiksi välttääkseen yleisesti esiintyviä virheitä, joista on raportoitu eri foorumeilla ja postituslistoilla. Nämä virheet johtuvat erilaisista tavoista, joilla laatikon mitat määritellään AutoDockissa (pisteiden määrä + ruudukkoväli) ja Autodock Vinassa (angströmeina), ja ne voivat aiheuttaa sen, että hakuavaruus on hyvin pieni tai liian suuri, mikä johtaa lopulta epäjohdonmukaisuuksiin saaduissa telakointituloksissa.

Amdockin integrointi PyMOL:iin on merkittävä etu. PyMOL on nimittäin laajalti käytetty molekyylien katseluohjelma, jolla on suuri yhteisön tuki ja aktiivinen kehitys. PyMOLissa telakointituloksia voidaan analysoida useilla työkaluilla, erityisesti tehokkaalla Protein-ligand Interaction Profiler -ohjelmalla . Muilla sovelluksilla, kuten ADT:llä, PyRx:llä tai DockingAppilla, on omat graafiset katselusovelluksensa. PyRx ja DockingApp tarjoavat yksinkertaisia ratkaisuja, joilla on rajalliset analyysimahdollisuudet, kun taas ADT mahdollistaa vain yksinkertaisen proteiini-ligandi-vuorovaikutusten analyysin.

Lisäksi AMDockilla on mahdollista käynnistää metalloproteiinien telakointisimulaatiot AutoDockin Zn-voimakentän avulla, joka on saatavilla ADT:ssä vain komentorivin kautta. Sen off-target-dockausvaihtoehto, joka on erittäin hyödyllinen lääkkeiden uudelleenkäytön tutkimuksissa, on käytettävissä vain Dockomaticissa ja PyRx:ssä (jälkimmäisessä vain maksullisessa versiossa).

Useimmat telakointi-GUI:t ovat keskittyneet virtuaaliseen seulontaan. Tällä hetkellä AMDockissa ei ole tukea virtuaaliselle seulonnalle, mutta työskentelemme parhaillaan sen toteutuksen parissa, jotta se olisi saatavilla seuraavassa ohjelmaversiossa.

Viimeiseksi, ja koska ADT on luultavasti laajimmin käytetty telakointi-GUI, esitämme yksityiskohtaisemman vertailun AMDockin ja ADT:n välillä (taulukko 1).

Taulukko 1 AMDock- ja AutoDock-työkalujen ominaisuuksien vertailu

Johtopäätökset

AMDock on käyttäjäystävällinen graafinen käyttöliittymä, joka toimii erittäin intuitiivisesti ja vuorovaikutteisesti, ja sen avulla on mahdollista suorittaa molekyylidockaustutkimuksia Autodock4:llä ja AutoDock Vinalla minimaalisella asetusten asettamisella. Nämä ominaisuudet tekevät AMDockista houkuttelevan työkalun myös opetustarkoituksiin. AMDock kerää ominaisuuksia ja menettelyjä, joita ei ole muissa vastaavissa ohjelmissa. Se sisältää AutoDockin viimeaikaisen kehityksen, kuten Autodock4Zn-parametrisoinnin. Ryhmällemme AMDock on ollut erittäin hyödyllinen arvioitaessa erilaisten PI3K-estäjien selektiivisyysprofiilia ortologisten proteiinien suhteen useissa mikro-organismeissa. Jatkokehitykset (hydratoitu ligandi, kovalenttinen telakointi ja virtuaalinen seulonta) sisällytetään telakointivaihtoehtoina tuleviin versioihin.