Tetramisol (Sigma T1512, en 10 mg/mL stamopløsning i H2O fortyndet til ca. 100 μg/mL i æggesalt) er valgfri; dette stof lammer ormene og gør det lettere at skære dem op. Der skæres straks: hvis ormene er for sammenknebne, vil de ikke frigive mange æg. Der skal bruges et nyt skalpelblad hver dag, da de hurtigt korroderer. Overskydende tetramisol vil resultere i, at der dannes en udfældning i NaOCl-opløsningen.

For at opnå et maksimalt udbytte kan der frigives flere æg ved at behandle afskårne orme i ca. 1 min. med et lige stort volumen NaOCl-opløsning tilsat direkte til skæredråben. Så snart æggene er frigivet, tilsættes samme volumen EGM som den anvendte NaOCl for at forhindre yderligere æggeskader. Denne behandling vil dræbe pronukleære stadier og beskadige encellede embryoner. Det er stadig nødvendigt med 3 minutters NaOCl-behandling, før der behandles med chitinase for at opnå en ensartet fordøjelse. For æg, der er tidligere end tocellestadiet, hvor skallen stadig er nogenlunde permeabel, tilsættes en lige så stor mængde EGM, så snart ormene er skåret op. Herefter kan mange overleve 3-min NaOCl- og chitinasebehandlingen, og nogle vil stadig være på en-celle-stadiet efter chitinasebehandling og fjernelse af vitellinhulen, hvis man arbejder hurtigt.

Tilfredsstillende overførselspipetter fremstilles af SMI mikropipettor 5- til 30-μL-kapillærer (Fisher 21-380-9C) eller World Precision Instruments 4-tommers kapillærer (1B100F-4), ved at trække to gange over en meget lille flamme. Dette gøres ved først at opvarme og trække forsigtigt for at lave en tynd midtersektion, derefter afkøle kortvarigt og derefter genopvarme mere forsigtigt, mens kapillæren holdes under spænding for det sidste træk. Det ideelle træk giver en pipette med et tydeligt skaft og en smal, gradvis tilspidsende sektion på ca. 3/4-1 tomme. En lille gasbrænder kan fremstilles ved at montere en stor sprøjtenål i en korkprop med en skrueklemme på slangen for at justere gasstrømmen. Alternativt kan pipetter af ensartet størrelse fremstilles ved at trække på en automatiseret puller. Før brug brydes kapillæren til den ønskede spids, ca. 100-150 μm (tre eller fire gange ægdiameteren), ved at klemme den mellem tommel- og fingernegl og fingerspids eller ved hjælp af et barberblad under et dissektionsmikroskop. Et Microforge-mikroskop kan hjælpe med at lave ensartede pipetter, selv om det ikke er nødvendigt. Pipettens diameter skal være lille for at minimere væskeoverførsel. Hvis æggene klæber fast på pipettens inderside, kan mange af dem genfindes ved at skylle med NaOCl-opløsningen eller EGM’en undervejs. Forvent at skifte pipetter ofte, og få trukket en god forsyning før en arbejdssession.

Hvis chitinasefordøjelsen ikke virker inden for 8 min, virker den sandsynligvis slet ikke. De mest almindelige problemer er hypoklorit eller ormenes fysiologiske tilstand (første dags æglægning synes at give hårdere æg). Hypoklorit skal være et parti, der ikke er udløbet, og det bliver normalt dårligt en måned eller deromkring før udløbsdatoen. Opbevar bestanden på køl i en mørk, ventileret flaske, der er fyldt næsten til toppen. Bland et 3-mL-rør lige før start og opbevar det på is; det virker i ca. 3 timer og bør derefter udskiftes.

Efter enzymbehandling og især efter permeabilisering er embryonerne ret klæbrige og vil klumpe sig sammen; dette kan minimeres ved at pipettere et eller kun nogle få ad gangen. Små klumper kan brydes op ved at udstøde dem fra pipetten med lidt kraft et par gange.

Permeabiliseringspipetterne trækkes i hånden på samme måde som overførselspipetterne, idet der anvendes Kwik-fil injektionskapillærer (1B100F-4 fra World Precision Instruments). Den indvendige tråd kan være med til at skære vitellinhulen over. Det ideelle træk giver en lang gradvis tilspidsning i det tynde snit, så det kan skæres til den ønskede diameter. Pipetterne skæres med en frisk skalpelklinge på Parafilm under dissektionskikkerten. Der kan laves en adapter til mundpipetten med en Tygon-slange med lille kaliber, der er skruet på en sprøjtenål, som er fastgjort til et mundrør. Pipettespidsen fyldes med EGM tilbage til den bredere boring og afprøves på det første parti af chitiniserede embryoner; pipettespidsen klippes om, hvis den er for lille. Den ideelle størrelse varierer alt efter embryonets alder; de meget tidlige stadier er mere skrøbelige og har brug for en lidt større boring; embryoner, der er større end otte celler, komprimeres med mindre skade og vil ofte komme ud af de større pipetter med vitellinhindehinden intakt. Sådanne ikke-permeabiliserede embryoner vil fortsætte med at udvikle sig til klækningsstadiet.

Brug en sprøjte på mundpipetten til påfyldning og rengøring af permeabiliseringspipetter; den egentlige permeabilisering sker ved hjælp af mundlufttryk. Pipetterne kan sidde i luften i flere timer uden at tørre ud, da boringen er så lille, men efterhånden som de tørrer ud, vil de til sidst blive tilstoppet. Opbevar pipetter (en god pipette er værd at værne om, og den holder i flere uger) ved at skylle spidsen flere gange med destilleret vand og suspendere pipettespidsen i et rør med sterilt destilleret vand eller 0,1 M HCl, ved hjælp af et tape-“flag” på pipetten, så den ikke synker helt ned.

Hvis pipetten er rigtig, tager det kun et par minutter at permeabilisere et parti embryoner ved at suge dem individuelt ind i pipetten og forsigtigt udstøde dem. De vil komme mere eller mindre komprimeret ud afhængigt af pipettens indre diameter, men runder sig igen i løbet af få minutter. Hvis der er meget lysis ved permeabilisering, var fordøjelsen enten ufuldstændig, eller pipettens boring var for lille. Da cellemembranerne er ret labile i 4-5 min. efter cytokinesens begyndelse, kan embryoner, der devitelliniseres under og lige efter spaltningen, lyse, eller blastomerer kan fusionere og senere gennemgå en unormal tetrapolær spaltning. Hvis det er kritisk, skal man kontrollere under et forsøg og fjerne sådanne embryoner.

En meget fin øjenvippe (et traditionelt elektronmikroskopisk værktøj) monteret på en tandstik med lim er det mest tilfredsstillende værktøj til hurtig manuel blastomerseparation; en glasnål virker også, men går let i stykker. Øjenvipper kan rengøres med sprit og et papirserviet. Blastomererne vil lyse, hvis de adskilles lige efter en deling; 5-10 min efter spaltning er det bedste tidspunkt for vellykkede manipulationer, medmindre man har brug for tidligere adskillelser. AB/P1-separationer er nemmest. Firecellede embryoner kan også adskilles. Alternativt kan man for at få P2- og EMS-blastomerer adskille P1 efter den første deling og EMS/P2 efter den anden deling for at få P2- og EMS-blastomerer. P-linjens blastomerer kan genkendes på deres relative størrelse og deres lineære placering. Med lavt udbytte kan MS, E, P3 og C adskilles fra de fire efterkommere af en oprindelig isoleret P1-blastomer. Celleidentifikationer foretaget på grundlag af cellestørrelse kan bekræftes ved at undersøge for forskellige cellecyklusperioder.

Articles

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.