Indikationer för bredbands 16S rDNA PCR
Bredbands 16S rDNA PCR kan påvisa både livskraftiga och icke livskraftiga bakterier, i likhet med qPCR. Den är också kliniskt användbar när andra tekniker ger negativa resultat, t.ex. vid odlingsnegativ endokardit, septisk artrit, meningit eller långväga infektioner.8 11 De bakterier som identifieras är ofta ovanliga, sällsynta, svåra att odla eller bakterier för vilka en specifik PCR inte finns tillgänglig.8 11 9 Som exempel kan nämnas identifiering av Helicobacter sp som den underliggande orsaken till osteomyelit eller Neisseria meningitidis som den oväntade orsaken till septisk artrit med hjälp av bred 16S rDNA PCR, efter att negativa resultat hade erhållits med andra mikrobiologiska diagnostiska tekniker.12 13
Det är också möjligt att göra distinktioner mellan arter: Ureaplasma spp består av två bakteriestammar, Ureaplasma parvum och Ureaplasma urealyticum, som inte kan särskiljas genom odling och som var och en misstänks orsaka olika patologi hos nyfödda.7 14 15 PCR med 16S rDNA på bred front, följt av sekvensering, har gjort det möjligt att särskilja och identifiera båda arterna, vilket underlättar forskningen om artspecifik patogenicitet.8 16
Det är också möjligt att med hjälp av PCR med 16S rDNA på bred front identifiera bakterier som tidigare inte har karakteriserats. Med hjälp av bred 16S rDNA PCR kunde Bartonella henselae och Tropheryma whippelii identifieras som de patogener som ligger till grund för kattskrapssjukan respektive Whipples sjukdom.17 18
Den breda omfattningen av 16S rDNA PCR med bred räckvidd gör den dock sårbar för kontaminering. Allt bakteriellt DNA som finns i ett prov amplifieras, även det som oundvikligen finns i reagenserna, vilket innebär att det är omöjligt att helt eliminera miljöföroreningar på låg nivå. Vid ett stort antal termiska cykler kommer detta bakgrunds-DNA att amplifieras och ge ett falskt positivt resultat. För att minska denna risk måste sekvensering utföras för att skilja mellan en äkta patogen och kontaminanter (ofta vattenburna bakterier som sannolikt inte orsakar sjukdom). Med hjälp av standardiserade sekvenseringstekniker kan endast den mest dominerande DNA-sekvensen identifieras, vilket innebär att i prover där mer än en bakterieart förekommer (t.ex. avföring) kan resultaten inte tolkas. Detta innebär att bred 16S rDNA PCR med standardsekvensering inte är användbar för prover från icke-sterila platser.
För att ytterligare minska risken för att bli överväldigad av kontaminering minskas antalet termiska cykler jämfört med specifika qPCR:er, men detta har den samtidiga effekten att känsligheten minskas.19 Detta innebär att bred 16S rDNA PCR alltid kommer att vara mindre känslig än en väl utformad specifik qPCR i storleksordningen 1-2 logs. En sista nackdel är att dessa metoder kan vara begränsade till forsknings- eller specialistlaboratorier, vilket innebär att proverna kan behöva skickas iväg, vilket ökar genomströmningstiden.16 En jämförelse av de viktigaste fördelarna och nackdelarna mellan odlingsmetoder, qPCR och bredskalig 16S rDNA PCR visas i tabell 1, och ett flödesschema över föreslagna undersökningar för misstänkta bakteriella sterila infektioner som omfattar både qPCR och bredskalig 16S rDNA PCR visas i figur 1C.
Sammanfattningsvis är bredspektrum 16S rDNA PCR ett viktigt komplement till mikrobiologisk diagnostik som en andra linje när infektion av ett sterilt område är starkt misstänkt, men odling och qPCR för de mest sannolika patogenerna har visat sig vara negativa. På grund av risken för att upptäcka bakteriell DNA-kontaminering utförs färre PCR-cykler än för qPCR, vilket resulterar i ett mindre känsligt test, varför qPCR bör användas först (figur 1C). Inom forskningen kommer 16S rDNA PCR att fortsätta att användas för att identifiera nya bakteriearter, karakterisera artspecifik patogenicitet och som en guldstandardanalys att jämföra med vid utvärdering av nya analyser. Det används också i kombination med banbrytande tekniker, t.ex. nästa generations sekvensering. Detta används för att karakterisera komplexa mikrobiella populationer i tarmen, avföringen, vagina, placenta, lungor och i miljöer.20 I takt med att nästa generations sekvensering baserad på bred 16S rDNA PCR blir mer prisvärd och allmänt tillgänglig har dessa tekniker potential att möjliggöra skräddarsydd terapi i takt med att vår förståelse för det komplexa samspelet mellan oss själva och våra mikrobiella samhällen ökar.21 Till exempel har bred 16S rDNA PCR av mikrobiella tarmsamhällen identifierat distinkta förändringar i tillstånd som hiv, för tidig födsel hos nyfödda och undernäring.22-24 När vi utforskar de potentiella terapeutiska vägar som avslöjats i dessa olika tillstånd, är det troligt att bred 16S rDNA PCR kommer att bli en hörnsten i ytterligare forskning.