Tetramisol (Sigma T1512, 10 mg/ml stamlösning i H2O, utspädd till cirka 100 μg/ml i äggsalt) är frivilligt att tillsätta; läkemedlet förlamar maskarna och gör det lättare att skära. Skär omedelbart: om maskarna är för sammandragna kommer de inte att släppa många ägg om de är för sammandragna. Använd ett nytt skalpellblad varje dag, eftersom de korroderar snabbt. Överskott av tetramisol kommer att leda till att en fällning bildas i NaOCl-lösningen.
För maximal avkastning kan fler ägg frigöras genom att behandla avklippta maskar i ca 1 min med en lika stor volym NaOCl-lösning som tillsätts direkt till skärdroppen. Så snart äggen frigörs, tillsätt samma volym EGM som NaOCl som använts för att förhindra ytterligare äggskador. Denna behandling dödar pronukleära stadier och skadar encelliga embryon. NaOCl-behandlingen på 3 minuter är fortfarande nödvändig före behandling med kitinas för att få en jämn nedbrytning. För ägg före tvåcellsstadiet, där skalet fortfarande är något genomsläppligt, tillsätt en lika stor volym EGM så snart maskarna skärs av. Efter detta kan många överleva 3-min NaOCl- och chitinasbehandlingen, och en del kommer fortfarande att befinna sig i encellsstadiet efter chitinasbehandlingen och avlägsnandet av vitellinhöljet om man arbetar snabbt.
Tillfredsställande överförings-pipetter tillverkas av SMI mikropipettor 5- till 30-μL-kapillärer (Fisher 21-380-9C) eller World Precision Instruments 4-tums kapillärer (1B100F-4) genom att dra två gånger över en mycket liten låga. Detta görs genom att först värma upp och dra försiktigt för att skapa en tunn mittsektion, sedan kyla av kort och sedan värma upp mer försiktigt samtidigt som kapillären hålls under spänning för det sista draget. Det idealiska draget ger en pipett med ett tydligt skaft och en smal, gradvis avsmalnande sektion på ca 3/4-1 tum. En liten gasbrännare kan tillverkas genom att montera en stor sprutnål i en kork, med en skruvklämma på slangen för att justera gasflödet. Alternativt kan pipetter av jämn storlek tillverkas genom att dra på en automatiserad dragare. Före användning bryter du kapillären till önskad spets, cirka 100-150 μm (tre eller fyra gånger äggdiametern) genom att klämma mellan tummenagel och fingertopp eller genom att använda ett rakblad under ett dissekeringsmikroskop. Ett Microforge-mikroskop kan hjälpa till att göra konsekventa pipetter, även om det inte är nödvändigt. Håll pipettens diameter liten för att minimera överföringen av vätska. Om äggen fastnar på pipettens insida kan många av dem återvinnas genom att spola med NaOCl-lösning eller EGM under tiden. Räkna med att byta pipetter ofta, och ha ett bra förråd dragit före en arbetssession.
Om chitinasnedbrytningen inte fungerar inom 8 minuter kommer den förmodligen inte att fungera alls. De vanligaste problemen är hypokloriten eller maskarnas fysiologiska tillstånd (första dagsläggning verkar ge segare ägg). Hypoklorit bör vara ett parti utan utgångsdatum, och det blir vanligtvis dåligt en månad eller så före utgångsdatumet. Förvara lagret i kylskåp i en mörk ventilerad flaska som är fylld nästan till toppen. Blanda ett 3-mL-rör precis innan du börjar och förvara det på is; det fungerar i ungefär 3 timmar och bör sedan bytas ut.
Efter enzymbehandling och särskilt efter permeabilisering är embryona ganska klibbiga och kommer att klumpa ihop sig. Detta kan minimeras genom att pipettera ett eller bara ett fåtal åt gången. Små klumpar kan brytas upp genom att med lite kraft utstötas ur pipetten några gånger.
Permeabiliseringspipetter dras för hand på samma sätt som överföringspipetterna, med hjälp av Kwik-fil injektionskapillärer (1B100F-4 från World Precision Instruments). Den inre tråden kan hjälpa till att skära av vitellinhöljet. Den ideala dragningen ger en lång gradvis avsmalning i den tunna sektionen så att den kan skäras till önskad diameter. Pipetter skärs av med ett friskt skalpellblad på parafilm under det dissekerande skopet. En adapter för munpipetten kan tillverkas med en Tygonslang med liten borrning som gängas på en sprutnål som fästs på en munpipett. Fyll pipettspetsen med EGM till den bredare borrningen och testa på den första omgången chitinaserade embryon; skär om pipettspetsen om den är för liten. Den idealiska storleken varierar beroende på åldern på det embryo du försöker få fram; de mycket tidiga stadierna är skörare och behöver en något större borrning; embryon som är större än åtta celler komprimeras med mindre skada och kommer ofta ut ur de större pipetterna med vitellinhöljet intakt. Sådana icke permeabiliserade embryon fortsätter att utvecklas till kläckningsstadiet.
Använd en spruta på munpipetten för att fylla och rengöra permeabiliseringspipetter; den egentliga permeabiliseringen sker med hjälp av lufttryck i munnen. Pipetterna kan sitta i luften i flera timmar utan att torka ut, eftersom borrningen är så liten, men när de torkar kommer de så småningom att täppas till. Förvara pipetter (en bra pipett är värd att slå vakt om och håller i flera veckor) genom att spola spetsen flera gånger med destillerat vatten och suspendera pipettspetsen i ett rör med sterilt destillerat vatten eller 0,1 M HCl, med hjälp av en tejpad ”flagga” på pipetten så att den inte sjunker ner helt och hållet.
Om pipetten är rätt tar det bara några få minuter att permeabilisera ett parti embryon genom att individuellt suga in dem i pipetten och försiktigt driva ut dem. De kommer att komma ut mer eller vara mindre komprimerade beroende på pipettens innerdiameter, men rundas upp igen inom några minuter. Om det blir mycket lysis vid permeabiliseringen var antingen digestionen ofullständig eller så var pipettens borrning för liten. Eftersom cellmembranen är ganska labila under 4-5 minuter efter det att cytokinesin börjar, kan embryon som devitelliniseras under och strax efter klyvningen lysera eller blastomererna kan smälta samman och senare genomgå en onormal tetrapolär klyvning. Om det är kritiskt, kontrollera under ett experiment och eliminera sådana embryon.
En mycket fin ögonfrans (ett traditionellt verktyg för elektronmikroskopi) monterad på en tandpetare med lim är det mest tillfredsställande verktyget för snabb manuell blastomerseparation; en glasnål fungerar också, men går lätt sönder. Ögonfransar kan rengöras med alkohol och en näsduk. Blastomerer lyserar om de separeras strax efter en delning. 5-10 min efter klyvning är den bästa tiden för lyckade manipulationer, om man inte behöver tidigare separationer. AB/P1-separationerna är lättast. Fyracelliga embryon kan också separeras. Alternativt, för att få P2- och EMS-blastomerer, kan P1 separeras efter den första delningen och EMS/P2 efter den andra. P-linjens blastomerer kan kännas igen på grund av sin relativa storlek och sitt linjära arrangemang. Med låg avkastning kan MS, E, P3 och C separeras från de fyra ättlingarna till en första isolerad P1-blastomer. Cellidentifieringar som gjorts på grundval av cellstorlek kan bekräftas genom att undersöka om det finns distinkta cellcykelperioder.