Drosophila-linjer
Vissa linjer (GMR57C10-Gal4, elav-Gal4, UAS-GCaMP6s, UAS-GCaMP6f, UAS-CD4:tdGFP och UAS-tdTomato) erhölls från Bloomington Stock Center. MAN-Gal4 (VT50660-AD; VT14014-DBD) och MDN-1-Gal4 (VT44845-DBD; VT50660-AD) tillhandahölls av B. Dickson (Janelia Research Campus). DNa01-Gal4 (SS00731: GMR22C05-AD; GMR56G08-DBD), DNb06-Gal4 (SS02631: GMR20C04-AD; BJD113E03-DBD), DNg13-Gal4 (SS02538: BJD118A10-AD; BJD123E03-DBD) och DNg16-Gal4 (SS01543: BJD104A07-AD; BJD107F12-DBD) tillhandahölls av G. Rubin (Janelia Research Campus).
Generering av Act88F:Rpr-konstrukt och flugor
Actin88F:Rpr-stammar (Act88F:Rpr-flugor) genererades med hjälp av en Actin88F:eGFP-konstruktion29. Act88F:GFP-linjen, som innehåller en eGFP-konstruktion som drivs av ett 2053 bp stort område av aktin88F-promotorn, erhölls från R. Benton (University of Lausanne). En Act88F:Rpr-konstruktion genererades genom att först använda följande primerpar för att lägga till en KpnI-restriktionsplats i 5′-änden av en rpr-cDNA-klon (IP02530, Drosophila Genomics Resource Center, Bloomington, IN) och en XbaI-plats i 3′-änden av den öppna läsramen, med hjälp av ett QuikChange Site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies):
Förward primer 5′ AGACGGTACCATATGGCAGTGGCATTC 3′
Reverse primer 5′ GCCGCGTCTAGATATCATTGCGATGGCTT 3′
Rpr-konstruktionen splicades sedan in i Act88F:eGFP-konstruktionen bakom Act88F-promotorn i stället för eGFP-sekvensen. Act88F:Rpr-konstruktionen injicerades i attp18 Drosophila-embryon för PhiC31 integrase-medierad platsspecifik transgenes35 (transgens landningsplats cytolokalisering 6C12) av BestGene Inc. (Chino Hills, CA). För vissa experiment kombinerades denna transgen med UAS-GCaMP6s-p2A-tdTomato (genererad i M.H.D:s laboratorium).
Fluorescensavbildning av indirekta flygmuskler
Fluorescensmikroskopi av halvtorka utfördes36,37. Kortfattat bedövades flugorna och deras huvuden och bukar avlägsnades sedan. Thoraces fixerades över natten i 4 % paraformaldehyd vid 4 °C och sköljdes i 1× fosfatbuffrad saltlösning (PBS) följande dag. Exemplaren arrangerades på ett glasobjektsglas, snabbfrystes i flytande kväve och delades i två delar i midsagittalplanet med hjälp av ett rakblad. IFM färgades med Alexa-Fluor 568 Phalloidin (1:100 i PBS med 0,1 % Triton-X (PBST)) över natten vid 4 °C, sköljdes med PBS och visualiserades med EVOS® FL Cell Imaging System (Life Technologies) vid ×4 förstoring. För helbildsbildning av IFM-myofibriller preparerades flugorna och thoracerna delades enligt beskrivningen ovan. Hemi-thoraces färgades med Alexa-Fluor 568 Phalloidin (1:100 i PBST) över natten vid 4 °C. Proverna sköljdes i PBS, monterades med Vectashield (Vector Laboratories) och visualiserades med hjälp av ett Leica TCS SPE RGBV konfokalmikroskop (Leica Microsystems) vid 100x förstoring.
Immunofluorescensavbildning av hjärnor och ventrala nervtrådar
Hjärnor och VNC:s dissekerades ur 2-3 dpe honflugor i PBS. Vävnaderna fixerades sedan i 20 minuter i 4 % paraformaldehyd i PBS i rumstemperatur. Efter fixering tvättades hjärnor och VNCs 2-3 gånger i PBS med 1 % Triton-X-100 (PBST) i 10 minuter vardera och inkuberades sedan vid 4 °C över natten i PBST. Proverna placerades sedan i PBST med 5 % normalt getserum (PBSTS) i 20 minuter i rumstemperatur. De inkuberades sedan med primära antikroppar (kanin anti-GFP 1:500, Thermofisher RRID: AB_2536526; mus anti-Bruchpilot/nc82 1:20, Developmental Studies Hybridoma Bank RRID: AB_2314866) utspädda i PBSTS i 48 timmar vid 4 °C. Hjärnor och VNC sköljdes 2-3 gånger i PBST i 10 minuter vardera före inkubation med sekundära antikroppar (sekundär antikropp av get mot kanin, konjugerad med Alexa 488 1:500; Thermofisher; sekundär antikropp av get mot mus, konjugerad med Alexa 633 1:500; Thermofisher) utspädda i PBSTS i 48 timmar vid 4 °C. Slutligen sköljdes hjärnor och VNCs 2-3 gånger i 10 minuter vardera i PBST och monterades på objektglas med täckglas i Slowfade-monteringsmedia (Thermofisher).
Proverna avbildades med hjälp av ett Carl Zeiss LSM 700 laserskanningskonfokalmikroskop med följande inställningar: Förstoringen är ×20, det dynamiska området är 8-bitars, bildmedelvärdet är 2×, pixelstorleken är 0,52 × 0,52 μm, z-stegsintervallet är 0,57 μm. Standardavvikelse z-projektioner av avbildningsvolymer gjordes med hjälp av Fiji38. För att jämföra GFP-uttryck i det centrala nervsystemet hölls laserintensiteten och PMT-vinsterna för den gröna kanalen konstanta i prover av vildtyp, A1 > GFP och Act88F:GFP.
Bildtagning av GFP-uttryck i benmusklerna
Benben dissekerades manuellt vid kroppens koaxaleder och monterades på glasobjektsglas med dubbelhäftande tejp. Slowfade mounting-media (Thermofisher) tillsattes sedan i utrymmet mellan täckglaset och objektglaset. Vi registrerade sedan GFP-fluorescensen i den gröna kanalen med hjälp av ett LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope (Zeiss). Laserintensitet, PMT-förstärkningar och skanningsparametrar hölls konstanta hos djur av vildtyp, MHC > GFP och Act88F:GFP: Förstoringsgrad ×20, dynamiskt intervall på 8 bitar, bildmedelvärde ×8, pixelstorlek 0,63 × 0,63 µm och z-stegsintervall på 10 µm. Cuticular auto-fluorescens registrerades också i den röda kanalen.
Thoracic dissection for VNC imaging
Anpassade hållare som användes för att montera flugor under bildtagning tillverkades enligt tidigare beskrivning39. För VNC-avbildning modifierades dessa stadier så att de hade i) platta i stället för vikta stålunderlag och ii) avfasade hörn för att göra det sfäriska löpbandet synligt för optiska flödessensorer (Shapeways, ”file”). Stålplattorna tillverkades av 0,001″ rostfritt stål, typ 316 mjukglödgad (McMaster-Carr, artikel nr 2317K11). Skjutbrickorna etsades (Etchit, Buffalo, MN) för att skapa rektangulära hål enligt förklaringen ”här”. Filen för utformning av shims finns här.
Alla experiment utfördes på 1-3 dpe honflugor som uppföddes vid 25 °C på standardmajsfoder i en 12 timmars ljus- och 12 timmars mörkercykel. Flugorna sövdes vid 4 °C. En honfluga valdes ut och i vissa fall klipptes vingarna av för att förenkla monteringen. Flugans dorsala bröstkorg trycktes sedan in genom ett hål i stålbrickan på bildtagningsbordet. Stativet vändes sedan, UV-härdande lim (Bondic, Aurora, ON Kanada) applicerades försiktigt runt bröstkorgen och härdades med UV-belysning (LED-200, Electro-Lite Co. Bethel, CT USA). UV-lim användes sedan för att fästa huvudet och buken på undersidan av scenen. Stativet fylldes sedan med extracellulär saltlösning18. Under ett dissektionsmikroskop med hög förstoring (Leica M165C) användes en hypodermisk nål (30 G, BD PrecisionGlide, Franklin Lakes, NJ, USA) för att skära och lyfta bort kutikulan från det dorsala bröstkorgen40 , varvid man var försiktig så att man inte skar av halsens bindväv. I djur som inte är Act88F:Rpr-djur användes därefter en slö tång för att ta bort IFM:er, främst från den främre-mediala delen av bröstkorgen som ligger över tarmen (detta steg är onödigt i Act88F:Rpr-djur). Denna process exponerar den dorsala ytan av proventriculus – en stor bulbformad tarmstruktur. Med stor försiktighet användes sedan en superfin pincett för att ta tag i och lyfta proventriculus för att förskjuta en stor del av tarmen (inklusive skörden och spottkörtlarna) från den mer ventralt belägna nervvävnaden. När tarmen på detta sätt var upphöjd användes en ultrafin sax (Fine Science Tools, Foster City, CA, USA) för att skära av den i den främre delen av tarmen. Proventriculus skalades sedan tillbaka och ett bakre snitt gjordes för att helt avlägsna dessa delar av tarmen och avslöja den underliggande nervvävnaden. Det är anmärkningsvärt att denna dissektion också tar bort aorta, vilket begränsar hemolymphflödet från det dorsala bukkärlet. Trots detta fann vi att flugorna var livskraftiga och uppförde sig i upp till 4 timmar. I vissa fall observerade vi att tarm- eller muskelvävnad började skymma VNC under avbildningen. Lös vävnad bör därför avlägsnas i detta skede samtidigt som man är mycket noga med att inte skära av VNC. Efter varje dissektion undersökte vi i vilken utsträckning djuret rörde benen som svar på en luftpuff eller tog tag i ett föremål med vart och ett av benen. Detta visade sig vara en exakt indikator på hur väl preparationen hade lyckats. För att utvärdera kvaliteten på en dissektion undersökte vi rörelserna av varje ben på det sfäriska löpbandet. Om en fluga kunde gå på ett koordinerat sätt ansågs dissektionen vara lyckad. I annat fall kategoriserades djuret som en djur med bristande rörelser i extremiteterna. Djur med flera dysfunktionella ben kategoriserades som oförmögna.
2-fotonmikroskopi under beteende
Experimenten utfördes på kvällen Zeitgeber-tid (Z.T.) och djuren avbildades vanligen 30-60 min efter dissektionen. Flyghållare fästes på en upphöjd plattform över det sfäriska löpbandet (kompletterande figur 3a). VNC lokaliserades sedan med hjälp av mikroskopokular och placerades i mitten av synfältet med hjälp av 2-fotonbildtagning.
Det sfäriska löpbandet är en aluminiumstång med ett kulformat hål fräst i ena änden22. Vi tillverkade skumkulor med en diameter på 10 mm (Last-A-Foam FR-7106, General Plastics, Burlington Way, WA USA) och prickade dem manuellt med hjälp av en Rapidograph-penna (Koh-I-Noor, Leeds, MA USA) för att ge högkontrastfunktioner för optiska flödesmätningar. En 500-600 ml min-1 ström av filtrerad och fuktad luft passerade genom hållaren med hjälp av en digital flödesregulator (Sierra Instruments, Monterey, CA, USA). Bollens rörelser mättes med hjälp av två optiska flödessensorer (ADNS3080) utrustade med zoomobjektiv (Computar MLM3X-MP, Cary, NC USA). Bollen och flugan belystes med hjälp av ett par IR-ljusdioder (850 nm toppvåglängd) kopplade till optiska fibrer och kollimatorlinser (ThorLabs, Newton, NJ, USA). De optiska flödesmätningarna överfördes till ett mikrokontrollerkort (Arduino Mega2560) för att registreras med hjälp av anpassad Python-kod. Samtidigt gjordes videoinspelningar av djurens beteende på bollen med hjälp av en IR-känslig firewire-kamera (Basler, Ahrensburg, Tyskland) med cirka 30 bilder per sekund.
Vi utförde 2-fotonmikroskopi med hjälp av ett Bergamo II-mikroskop (ThorLabs) utrustat med två GaAsP PMT-detektorer för GCaMP6- och tdTomato-avbildning och kopplat till en Ti:Sapphire-laser (MaiTai DeepSee, Newport Spectra-Physics, Santa Clara, CA USA) inställd på 930 nm. Vi använde ett Olympus 20× vattenimmersionsobjektiv med 1,0 NA (Olympus, Center Valley, PA USA). Mikroskopet styrdes med hjälp av programvaran ThorImage (ThorLabs). Experiment med koronala snittbilder utfördes i Galvo-Galvo-bildläget vid 6-9 Hz. Bildfrekvensen varierade med bildstorleken som varierade mellan 26,58 × 26,58 µm och 53,15 × 53,15 µm. Lasereffekten varierade mellan 3 mW och 5,7 mW. Volumetrisk avbildning är också möjlig med lämplig hårdvara (t.ex. galvo-resonansskanner och piezo-driven objektivkrage).
Undertiden användes en luftpuff för att framkalla gångbeteenden. Dessa puffar kodades digitalt (Honeywell AWM 3300 V, Morris Plains, NJ USA). Anpassad ROS-programvara som via en analog utgångsenhet (Phidgets, Calgary, Kanada) kopplades till ThorSync-programvaran (ThorLabs) användes för att synkronisera mätningar av det optiska flödet, videofilmning av beteende, luftpuffmätningar och 2-fotonbildförvärv. För koronala snittbilder användes en piezokrage (Physik Instrumente, Karlsruhe, Tyskland) för att kontrollera mikroskopobjektivets snabba z-axelrörelser.
För att jämföra den neurala aktiviteten mellan kontroll- och Act88F:Rpr-djur förvärvade vi bilder med 512 × 512 pixlar vid 1,7 bilder per sekund med en konstant laserintensitet och PMT-förstärkning. Utvalda avbildningsregioner valdes empiriskt som horisontella sektioner bestående av landmärken som observerades på ~61-65 µm djup i Supplementary Movie 1.
Genom att jämföra gång med eller utan dissektion
För att utvärdera effekterna av dissektion på lokomotion utsattes djur av vildtyp för följande procedur. Djuren monterades på avbildande stadier och saltlösning tillsattes till varje stadie. Endast en slumpmässig delmängd av djuren dissekerades. Varje monterad fluga placerades sedan på det sfäriska löpbandet och dess gångbeteende registrerades under 30 minuter. Det optiska flödet registrerades enligt beskrivningen ovan. För att öka sannolikheten för lokomotion riktades en 500 ms-puls av 100 % CO2 mot flugans antenner med en min interpulsintervall (0,05 ln min-1 med hjälp av en massflödesregulator; Vögtlin Instruments, Schweiz).
Infraröd laserstimulering av antennerna
För att jämföra gångbeteendena mellan Act88F:Rpr- och kontrolldjuren, stimulerade vi deras antenner med en nära infraröd laser på 830 nm (Schäfter + Kirchhoff, Tyskland). Vi sövde först 7-8 dpe hondjur vid 4 °C och monterade dem på avbildningsbord. Flugorna acklimatiserades sedan i 10 minuter. För varje experiment fick ett djur tio 2 s laserstimuleringspulser (18,1 mW) till sin högra antenn med 60 s intervall mellan pulserna. Kontroll- och Act88F:Rpr-djur testades växelvis för att minimera effekterna av cirkadisk tid på beteendejämförelser.
Statistik
Sampelstorlekarna för djurförsöken valdes enligt följande: vi utförde minst tre experiment för att illustrera populations- och glesa neurala inspelningar och utförde mer än tio experiment per grupp när vi utförde statistiska jämförelser. Ett i förväg fastställt kriterium för låga signal-brus-fluorescenssignaler resulterade i att två MDN-experiment togs bort från vårt dataset. Ingen randomisering eller blindning användes. För antennlaserstimulering var data inte normalfördelade, varför Friedman- och Mann-Whitney U-test utfördes. Uppskattningar av variation presenteras som medelvärde och bootstrappade 95 % konfidensintervall.
Dataanalys
Vi analyserade alla data med hjälp av anpassade Python-skript. Eftersom datainsamlingsfrekvensen skiljde sig åt för optiskt flöde, beteendevideografi och 2-fotonbildtagning interpolerade vi signalerna för att matcha dem med den högsta frekvensen. Därefter jämnades optiska flödesdata ut med hjälp av ett löpande medelvärde (fönster = 200 ms) och översattes sedan till rotationer s-1 för anterior-posterior, medial-lateral och yaw-axlar22. För att göra dessa mätningar mer intuitiva omvandlades rotationer s-1 sedan till mm s-1 (1 rot s-1 = 31,42 mm s-1) för anterior-posterior (vforward) och medial-lateral (vside) rörelser och till grader s-1 (1 rot s-1 = 360° s-1) för yaw (vrotation) rörelser22.
Analysen av lokomotion i dissekerade djur (kompletterande figur 2) utfördes på följande sätt. Vforward optiska flödesdata för 20 dissekerade och 20 icke-dissekerade flugor downsamplades till 1500 punkter s-1 och jämnades ut med hjälp av ett löpande medelvärde av varaktighet 0,2 s. För att beräkna den procentuella andelen av tiden som går framåt/bakåt eller i sidled definierades två tröskelvärden, -0,31 mm s-1 och +0,31 mm s-1, empiriskt för att skilja mellan att stå stilla och att gå framåt (högerut) respektive bakåt (vänsterut). Värden över 0,31 mm s-1 betraktades som moment av framåt (höger) gående och värden under -0,31 mm s-1 betraktades som moment av bakåt (vänster) gående. Optiska flödesvärden mellan dessa tröskelvärden betraktades som stunder av stillestånd. Procentandelen gångtid beräknades som andelen datapunkter där ett djur inte ansågs stå stilla. På samma sätt användes tröskelvärden på 10,8 och -10,8 grader s-1 för att definiera moment av vändning. Ett anfall definierades som en kontinuerlig period av gång eller vändning.
Stora vävnadsdeformationer kan förekomma under beteendet. Därför utförde vi post hoc pan-neuronal bildregistrering (fig. 2). Vi registrerade alla ramar från ett bildförsök till en referensbild. Eftersom deformationernas komplexitet inte kunde fångas med hjälp av enkla parametriska rörelsemodeller (t.ex. affintransformationer) använde vi en icke-parametrisk, variationell metod som är utformad för att modellera godtyckligt komplexa deformationer. Vi beräknade rörelsefältet w mellan referensbilden, betecknad Ir, och bilden vid tiden t, betecknad It, genom att lösa minimeringsproblemet
där D(w) är en term för anpassning av data, den andra termen är en reglering som främjar jämnheten hos w genom att straffa dess gradient ∇w41, Ω är den diskreta bilddomänen och parametern λ balanserar bidragen från de två termerna.
GCaMP6s bilder utgör en utmaning för rörelseuppskattning eftersom neurala aktiviteter ger upphov till stora lokala intensitetsförändringar. Därför använde vi ytterligare en aktivitetsoberoende fluorofor, tdTomato, och definierade en dataterm av formen
Den första termen modellerar standardantagandet om bevarandet av intensiteten längs varje pixels bana. Den definieras genom
där vi använder en \(\ell _1\)-norm för att få partiell robusthet mot intensitetsförändringar42. Den andra termen i Eq. (2) är en begränsning för matchning av egenskaper inspirerad av Revaud och medarbetare43, skriven som
I ekvationerna (2)-(4) är Ir och It från tdTomato-kanalen. Minimering av funktionen ϕ gynnar rörelsevektorer w(x) som ligger nära funktionskorrespondenser m(x, Ir, It), beräknade på en gles uppsättning relevanta nyckelpunkter. Vi får fram m med den algoritm för funktionsmatchning som föreslagits av Revaud och medarbetare43 , som är särskilt utformad för att hantera stora bilddeformationer. Vi beräknar m med hjälp av bildkanalen tdTomato, så att korrespondenserna också är okänsliga för intensitetsförändringar mellan Ir och It. Som ett resultat av detta styrs uppskattningen av tillförlitliga matchningar av egenskaper. Parametern γ balanserar de två termerna i ekv. (2).
För varje experiment optimerade vi värdena för λ och γ med hjälp av en rutnätssökning för att registrera horisontella sektionsbilder av VNC (kompletterande figur 4). Som målfunktion för optimeringen använde vi gradienten för den temporala medelbilden44. Små värden på λ (dvs. λ < 1000), ledde ibland till artefakter i de registrerade bilderna. Dessa artefakter var förknippade med stark konvergens i vektorfältet w(x) (kompletterande figur 4c). Därför definierade vi empiriskt artefakter som kluster av pixlar med \({\mathrm{div}}\,{\mathbf{w}}\left( {\mathbf{x}} \right) < – 1,2\) och kardinalitet >20 (vi fick liknande resultat med kardinalitet >5). Slutligen valde vi λ- och γ-värdena som de med inga artefakter och den högsta gradienten för medelbilden. Exempel på oregistrerade bilder, transformationsvektorfält och registrerade bilder av de tre optimerade exemplen visas i Supplementary Movie 5.
Vi löste optimeringsproblemet i Eq. (1) med en ADMM-algoritm (alternated direction method of multiplier)45. Vi införde två uppdelningsvariabler som är kopplade till reguleringstermerna respektive termerna för funktionsmatchning. Varje delproblem i algoritmen löstes analytiskt. Vi använde delar av biblioteket för inversa problem som beskrivs i ref. 46. En efterbehandling baserad på viktad medianfiltrering tillämpades med metoden från47.
I fig. 2 annoterades beteenden halvautomatiskt, med hjälp av en anpassad Python-modul. Denna modul gör det möjligt för användaren att välja två intresseområden (ROIs) på videons första bild. Den första ROI används för att upptäcka gång och måste placeras över de metathorakala och mesothorakala benen. Det andra ROI-området är ansvarigt för att upptäcka att prothoracala ben putsas och måste vara placerat framför flugan. För att upptäcka rörelse i dessa områden subtraheras på varandra följande bilder. De resulterande differentialbilderna är sedan medianblurade (radie = 5 pixlar) för att minska bruset. På grundval av denna suddiga bild tillämpas ett tröskelvärde för antalet pixlar som inte är nollor i var och en av de två ROI:erna för att extrahera binära sekvenser av putsningar och gångsträckor. Observera att prothoracala benrörelser som observeras under gång ignoreras (dvs. klassificeringen av pälsdjur är underordnad klassificeringen av gång). Ett hysteresisfilter användes sedan för att lågpassfiltrera binära beteendesekvenser och för att ta bort övergångar som inträffar i för få bilder för att vara biologiskt rimliga. Exempel på ROIs och beteendeanteckningar illustreras i tilläggsfilm 6. Dessa beteendedata användes i figur 2 som visas i tilläggsfilm 2. De annoterades med följande parametrar: tröskelvärde för gång = 400, tröskelvärde för putsning = 5, hystereselängd för gång = 8, hystereselängd för putsning = 10.
För fig. 2b, c använde vi linjär regression för att hitta regioner i VNC som är associerade med antingen gång eller putsning. Regressorer Xw och Xg (för gång respektive putsning) konstruerades från de två beteendesekvenserna Sw och Sg med hjälp av Eq. (5) genom konvolution med en exponentiellt avklingande kalciumsignal Impulsrespons (CIR) som härrör från tidskonstanten som uppmättes för GCaMP6s (t½ = 1,1448 s)19.
Målfunktionerna var pixelvisa ∆F/F-spår, där ∆F = Ft – F. Ft är fluorescensen vid tiden t. F är en baslinje-fluorescenssignal som mäts som genomsnittligt pixelvärde för de första tio på varandra följande GCaMP6s-bilderna där ingen cellulär aktivitet observerades (dvs, minimal och oförändrad GCaMP6s-fluorescens).
Regressorvikterna beräknades med hjälp av ekv. (6).
där y är det pixelvisa ∆F/F-spåret.
Figur 2b, c visar värmekartor över regressorvikterna, ww för gång och wg för grooming, normaliserade till sina respektive maxima. ROI 1 valdes som en region i värmekartan med en hög vikt för grooming men en låg vikt för walking. ROI 2 valdes som den rumsliga platsen med det högsta värdet för ww. Varje ROI omfattar en region med en radie på 15 pixlar.
För att identifiera processen glesa neurala bilddata (fig. 3-5) valdes först ROI:erna ut med hjälp av anpassade Python-skript som var beroende av OpenCV- och Numpy-biblioteken. För att göra detta valdes en referensram för vilken programvaran identifierade alla potentiella ROI:er. För att göra detta slätades GCaMP6s-bilden ut för att minska bakgrundsbruset och sedan applicerades ett tröskelvärde för Otsu-filter på bilden. En erosionsfaktor tillämpades sedan på alla objekt som upptäcktes i bilden. Konturerna av alla upptäckta objekt presenterades sedan för användaren för manuellt val. När dessa referens-ROI:er väl hade valts ut för vänster och höger neuron använde vi en korskorrelationsbaserad bildregistreringsalgoritm48 för att identifiera de mest sannolika vänstra och högra ROI:erna för varje bildruta baserat på dem som valts ut manuellt på referensrutan. Ett andra skript användes för att manuellt verifiera automatiskt valda ROI:er och, om de var felaktiga, för att visa alla potentiella ROI:er inom ramen för manuellt val. Om erosionsvärdena gav missbildade ROI:er användes ett annat skript för att manuellt placera elliptiska ROI:er med godtycklig orientering på varje given bildruta. Slutligen användes binära ROI-bilder som en bildmask för att extrahera genomsnittliga fluorescenssignaler från de ursprungliga GCaMP6s- eller tdTomatobilderna. Dessa signaler rapporterades som %∆R/R som i ref. 49 för att minska effekterna av rörelse på våra mätningar. På grund av avsaknaden av stimuli beräknades baslinjen R som det minsta förhållandet mellan GCaMP6s/tdTomato inom en 2,5 s bin.
För att upptäcka övergående ökningar av aktiviteten utvecklade vi en algoritm som delvis bygger på ref. 50. Vi fastställde först när den första derivatan av %∆R/R-signalen passerade ett tröskelvärde, vilket bestämdes genom att undersöka alla derivatvärden för en viss neuronklass (MDN, MAN eller A1). Vi resonerade att tröskelvärdena bör vara karakteristiska och potentiellt olika för varje typ av neuron eftersom fluorescensdynamiken är relaterad till inneboende fysiologiska egenskaper som kan skilja sig åt mellan olika neuronklasser men inte mellan olika experiment för en enskild klass. Vi fastställde detta tröskelvärde som 97,5:e percentilen för MDN och dMAN och 90:e percentilen för A1-neuroner. Ett lägre tröskelvärde valdes för A1-neuroner eftersom många fler fluorescensövergångar observerades i A1-spår. Dessa transienter skulle ha förbisetts om man hade använt ett tröskelvärde på 97,5:e percentilen. För att identifiera början av fluorescensökningar hittade vi den närmast föregående tidspunkten där derivatan passerade noll. Detta nollöverskridande anses vara tidpunkten för en ”händelse” i samband med den identifierade fluorescensökningen. Händelser som upptäcktes nära varandra utan mellanliggande derivatnollgenomgång komprimerades till en händelse förknippad med den första tidspunkten. Det fanns ~10 separata experiment per djur. Händelser under de första och sista 10 s av varje experiment beaktades inte eftersom datapresentationsfönstret omfattade 10 s före och 10 s efter varje händelse.
Eftersom aktiviteterna i vänster och höger MDN och dMAN var starkt samvarierande (kompletterande figur 5) utfördes ytterligare ett steg för händelsedetektering: om händelser detekterades i både vänstra och högra neuron inom 2 s från varandra, behölls båda händelserna; i annat fall identifierades en händelse som identifierats för neuron A (t.ex, vänster MDN) och inte neuron B (t.ex. höger MDN) lades också till neuron B:s händelsebibliotek.
Däremot samvarierade inte vänster och höger A1-aktiviteter starkt. Därför förknippades händelser med den ena och inte den andra neuronen. För att åstadkomma detta, om en händelse upptäcktes för både vänster och höger A1-neuron inom ett tidsfönster på 0,25 s, användes ingen av händelserna för analys.
%∆R/R och optiska flödesspår kopplade till varje händelse anpassades genom att ställa in händelsernas tidpunkter till 0 s. Vi beräknade sedan medelvärdet och bootstrappade 95 % konfidensintervall för dessa anpassade spår med hjälp av Python Seaborn-biblioteket. Mätningar av det optiska flödet och %∆R/R minskades till 500 värden s-1 för denna analys. För att öka tydligheten subtraherades %∆R/R-spåren från baslinjen så att de blev noll vid tidpunkten för händelsen i de sammanfattande panelerna (fig. 3d, 4d och 5d, e). Kontroll, blandade data (grå spår) beräknades genom att i stället tilldela slumpmässiga tidpunkter i stället för verkliga, identifierade händelser. Dessa slumpmässiga tidpunkter behandlades som verkliga händelser och deras medelvärde och bootstrappade 95-procentiga konfidensintervall beräknades och plottades för jämförelse.
Kovariansanalys (kompletterande fig. 5) utfördes med hjälp av ett specialanpassat Python-skript som var beroende av biblioteken Matplotlib och Numpy. Scatter plots beräknades för att jämföra vänster och höger neurons %∆R/R-värden från alla experiment för varje fluga separat. Pearsons r-värden rapporteras som medelvärde ± standardavvikelse.
Eventrelaterade beteenden (Supplementary Movies 8, 10, 12 och 13) valdes ut manuellt från automatiskt upptäckta händelser enligt beskrivningen ovan. För dMANs valdes händelserna ut bland dem som maximerade skillnaden i anterior-posterior bollrotationer mellan 1 s före och 2 s efter händelsen. För MDN valdes händelserna ut bland dem som minimerade anterior-posterior bollrotationer upp till 2 s efter händelsen. För A1-neuroner valdes händelserna ut bland dem som maximerade de genomsnittliga girakbollsrotationerna (positiva för exempel på vänster A1-neuron och negativa för exempel på höger A1-neuron) upp till 2 s efter händelserna.
I den kompletterande figuren 8 har svaren på nära infraröd laserstimulering medelvärdesberäknats över 10 försök för varje djur. Det optiska flödet nedskalades till 500 värden s-1. Medelvärde och 95 % bootstrappade konfidensintervall för optiska flödesspår mättes och plottades med hjälp av Python-biblioteket Seaborn. Python Scipy-biblioteket användes för att utföra Friedman- och Mann-Whitney U-tester.