AMDock: ett mångsidigt grafiskt verktyg för att underlätta molekylär dockning med Autodock Vina och Autodock4

Molekylär dockning har blivit ett kraftfullt verktyg för upptäckt och optimering av ledtrådar. Ett stort antal dockningsprogram har utvecklats under de senaste tre decennierna, baserade på olika sökalgoritmer och poängfunktioner. För att göra dessa dockningsprogram mer användarvänliga, särskilt för nybörjare, har olika grafiska användargränssnitt (GUI) utvecklats för att hjälpa till att förbereda molekylära system, utföra beräkningar och/eller analysera resultaten. Exempel på tillgängliga grafiska användargränssnitt (som oftast utvecklats för AutoDock och/eller Autodock Vina ) är AutoDock Tools (ADT), integrerat i det grafiska paketet PMV , BDT , DOVIS , VSDocker , AUDocker LE , WinDock , DockoMatic , PyMOL AutoDock plugin (PyMOL/AutoDock) , PyRx , MOLA , DockingApp och JADOPPT .

Vi presenterar här ett nytt verktyg för flera plattformar, AMDock (Assisted Molecular Docking), vars främsta fördel jämfört med sina föregångare är integrationen av flera värdefulla externa verktyg i ett enkelt och intuitivt grafiskt gränssnitt som vägleder användarna längs väletablerade dockningsprotokoll – med hjälp av antingen Autodock4 eller AutoDock Vina – från förberedelse av systemet till analys av resultaten.

Funktioner och arbetsflöde

AMDock integrerar funktioner från Autodock Vina och Autodock4, ADT-skript, AutoLigand , Open Babel , PDB2PQR och PyMOL . För proteiner som innehåller en zinkjon i den aktiva platsen har AMDock möjlighet att använda de specialanpassade Autodock4Zn-parametrarna. AMDock är kodat i Python 2.7 och finns tillgängligt för Windows och Linux. På Windows är den paketerad tillsammans med alla integrerade verktyg, varför ingen ytterligare programvaruinstallation krävs. På Linux bör endast Open Babel och PyMOL installeras (båda verktygen ingår i de flesta populära Linuxförråden).

Det huvudsakliga AMDock-fönstret har fem flikar: 1) Hem, 2) Dockningsalternativ, 3) Resultatanalys, 4) Konfiguration och 5) Info. En sammanfattning av AMDocks funktioner och arbetsflöde presenteras nedan (fig. 1) och diskuteras därefter mer i detalj.

I fliken ”Home” kan användaren välja dockningsmotor: Autodock Vina eller Autodock4, med ytterligare möjlighet att använda Autodock4Zn-parametrarna. Därefter leds användaren automatiskt till fliken ”Docking Options”, som innehåller fyra paneler som vägleder en sekventiell förberedelse av en dockningssimulering.

Inputfiler för AMDock

Minimalt behövs de kartesiska koordinaterna för ligand- och receptormolekylerna, som kan tillhandahållas i flera vanliga strukturformat, t.ex. PDB eller PDBQT för proteinet, och PDB, PDBQT eller Mol2 för liganden. Om proteinkoordinaterna kommer samman med en bunden ligand lagras koordinaterna för de senare och kan användas efteråt för att definiera sökutrymmet.

Programmet fungerar genom att följa tre huvudsteg:

1. 1-

   Förberedelse av dockinginmatningsfilerna: Först kan användaren ställa in ett pH-värde för protonering av både liganden (valfritt, standardvärde 7,4) med hjälp av Open Babel och proteinet (standardvärde: 7,4) med hjälp av PDB2PQR. Två olika dockningsalternativ är tillgängliga: a) ”enkel dockning”, för att förutsäga bindningsläget för ett enda protein-ligandkomplex, och b) ”off-target-dockning”, för att förutsäga bindningsläget för en ligand med två olika receptorer, dvs. målreceptorn och off-target-receptorn. Slutligen gör alternativet ”Scoring” som ingår i denna flik det möjligt att poängsätta ett redan befintligt protein-ligandkomplex med hjälp av funktionerna Autodock Vina, Autodock4 eller Autodock4Zn. När väl docknings- eller poängprotokollet har valts förbereds inmatningsfilerna med hjälp av ADT-skript.

2. 2-

   Definiering av sökutrymmet: Fyra olika tillvägagångssätt kan användas för att definiera boxens centrum och dimensioner: a) ”Automatisk” – programmet använder AutoLigand för att förutsäga möjliga bindningsställen och sedan centreras en box med optimala dimensioner på varje AutoLigand-objekt,Fotnot 1 vid varje förutsagd bindningsställe. b) ”Centrerad på rest(er)” – AutoLigand används för att generera ett objekt med en volym som motsvarar ligandens storlek, med det geometriska centrumet för de valda resterna som referens. Därefter centreras en ruta med optimala dimensioner på det genererade objektet. c) ”Center on Hetero” – en ruta placeras på det geometriska centret för en befintlig ligand (om receptorn gavs i komplex med en ligand), och d) ”Box” – rutaens centrum och dimensioner definieras av användaren. Boxen som genereras med någon av dessa metoder kan visualiseras i PyMOL och enkelt ändras när det passar användaren med hjälp av det nya insticksprogrammet AMDock (anpassat från ) som är inbäddat i PyMOL:s menyfönster.

3. 3-

   Körning av dockningssimuleringarna och analys av resultaten: Efter att ha kört de molekylära dockningsberäkningarna (startat genom att klicka på knappen ”Run”) kommer användaren automatiskt till fliken ”Results Analysis” (resultatanalys), där affiniteten, de uppskattade Ki värdena och Ligand Efficiencies listas för de olika bindningsposterna.

Den uppskattade Ki är ett mycket användbart värde eftersom det är mer relaterat till de vanligen uppmätta experimentella parametrarna, jämfört med affiniteten. Ligandens effektivitet (LE) är å andra sidan en viktig informativ parameter när man väljer en ledande förening . Här beräknas LE med hjälp av följande ekvation:

där ΔG är den fria bindningsenergin eller det beräknade poänggivande värdet och HA är antalet tunga (icke-vätgas-) atomer i liganden. Föreningar med LE > 0,3 markeras som potentiella ledande föreningar .

Knappen ”Show in PyMOL” startar PyMOL med en anpassad visualisering av komplexet mellan receptorn och den valda posen (den ligandposen med lägst energi väljs som standard). De resulterande uppgifterna under hela processen lagras i en fil (*.amdock), som kan användas för att undersöka resultaten när som helst senare.

Differenta dockningsparametrar kan ställas in i fliken ”Configuration”, medan fliken ”Info”, ger tillgång till praktisk dokumentation, inklusive en användarmanual och referenser.

Visualisering

AMDock förlitar sig på PyMOL för visualisering i två olika steg: 1) inställning av gridboxens placering och dimensioner (sökutrymmet) och 2) analys av dockningsresultaten. PyMOL är ett mångsidigt och användarvänligt program för molekylär analys som dessutom gör det möjligt att skapa högkvalitativa bilder för publicering. Vi har i AMDock kodat flera förutbestämda PyMOL-representationer för de två stegen och valt den visuella utformning och information som vi ansåg vara optimal i varje enskilt fall. Dessa fördefinierade representationer kan ändras av användaren i PyMOL.

Sökutrymme

De förbestämda representationerna (i fallande ordning av komplexitet, enligt antalet element i visualiseringsinnehållet) är följande: 1) Box – en enkel representation där det studerade proteinet visas som en tecknad figur, tillsammans med boxen med de specifikationer som definierats av användaren (fig. 2a); 2-Centered on Hetero – innefattar receptorproteinet (tecknad figur) och boxen med optimal storlek centrerad på den valda tidigare liganden (pinnar) (fig. 2b); 3-Centered on Residue(s) – en representation som gör det möjligt för användaren att identifiera de rester som valts ut för att definiera sökutrymmet. Proteinet representeras som en teckning, de valda resterna som pinnar och AutoLigand-objektet som punkter. Den beräknade rutan visas också, så att användaren lätt kan kontrollera och justera (vid behov) dess position och dimensioner (fig. 2c). 4-Automatic – Här avsåg vi att skapa en förenklad representation för att visa alla bindningsställen som förutsetts av AutoLigand. Proteinet är tecknat, varje AutoLigand-objekt är representerat i pinnar, omgivet av en yta som konstruerats på dess grannrester. Eftersom dockningssimuleringar ska utföras för varje plats som förutsägs av AutoLigand genereras en ruta för varje plats, men den visas endast för en plats som valts av användaren (fig. 2d). Som nämnts ovan kan boxens centrum och storlek i alla dessa varianter enkelt ändras med hjälp av AMDock-pluginet som implementerats i PyMOL.

Resultatanalys

Proteinet är representerat i tecknad form. Varje ligandposition är ritad med pinnar och dess polära kontakter med proteinet visas som streckade linjer. En liknande visualisering är också möjlig för båda proteinerna om förfarandet ”Off-Target Docking” valdes (fig. 3c). Detta möjliggör en samtidig jämförelse av ligandposer för både målproteiner och off-target-proteiner.

Fallstudie: SAR405 bindningsselektivitet – PI3Kγ vs Vps34

Phosphatidylinositol 3-kinas (PI3K) är ett enzym som är involverat i tillväxt, proliferation, motilitet, överlevnad och intracellulär trafikering . PI3K är också en lovande måltavla för cancer, och flera av dess hämmare befinner sig redan i det kliniska stadiet. Några av dessa hämmare befinner sig för närvarande i kliniska fas III-studier och en av dem, alpelisib, fick nyligen (maj 2019) FDA-godkännande för användning vid behandling av metastaserad bröstcancer.

PI3K har flera isoformer som är grupperade i 3 olika klasser. Klass I omfattar fyra olika isoformer (α, β, γ och δ), medan klass III består av endast ett protein, kallat Vps34 . På grund av deras sekvens- och strukturella likheter kan vissa hämmare binda olika isoformer, medan flera andra hämmare har utformats för att vara isoformspecifika. Vår forskningsgrupp fokuserar för närvarande på att identifiera PI3K-hämmare som kan hämma PI3K-ortologer som finns i olika patogena mikroorganismer, vilka endast uttrycker den ursprungliga Vps34-isoformen. För detta ändamål är AMDock ett värdefullt verktyg, särskilt dess alternativ ”Off-Target Docking”. Här demonstrerar vi dess användning med en övning som liknar vårt eget forskningsarbete.

Sar405 är en mycket specifik hämmare av Vps34 (IC50 = 1,2 nM), medan dess IC50 för andra isoformer är > 104 nM . En kristallstruktur av SAR405 i komplex med mänsklig Vps34 finns tillgänglig i Protein Data Bank (PDB-kod: 4oys). Här använder vi humant Vps34 som ”Target”-receptor, medan PI3K gamma-isoformen (PDB: 3apf) används som ”Off-Target”-receptor. Båda strukturerna innehåller en bunden ligand i den aktiva platsen, vilket är lämpligt för att generera rutnätet. I det första steget väljer vi dockningsprogrammet (Autodock Vina) och därefter skapas en projektmapp på datorns hårddisk. Efter att ha laddat in de båda proteinstrukturerna drar vi nytta av deras sekvenslikhet för att använda det tillgängliga alternativet att anpassa och överlagra deras strukturer med hjälp av PyMOL, vilket gör det möjligt att definiera ett gemensamt sökområde och förenklar den efterföljande analysen av dockningsresultaten. Därefter förbereds inmatningsfilerna automatiskt, vilket inkluderar protonering av titrerbara rester, sammanslagning av opolära väteämnen och borttagning av joner/vatten. Boxens centrum definieras utifrån de bundna ligandrarnas geometriska centrum (fig. 3a), medan boxens storlek definieras utifrån gyrationsradien för den ligand som ska dockas, dvs. SAR405-hämmaren i det här fallet. Den ursprungliga ligandkonformationen (dess torsionsvinklar) randomiserades med hjälp av ADT.

När processen är avslutad visar resultaten att SAR405 är mer selektiv för Vps34 (- 9,2 kcal/mol) än för Pi3Kγ (- 7,3 kcal/mol) som förväntat (fig. 3b). Den förutspådda bindningsställningen för SAR405 i Vps34 ligger nära kristallgeometrin (rmsd = 1,9 Å för alla ligandatomer, rmsd = 0,5 Å för ringkärnan). Det förutspådda Ki värdet för detta komplex ligger också i det nanomolära området, vilket stämmer överens med det experimentella värdet. Å andra sidan förutsägs ett mycket högre Ki -värde för Pi3Kγ-SAR405-komplexet, och den förutsagda bindningspositionen skiljer sig avsevärt från den kristallografiska strukturen (rmsd = 4,7), vilket visas i fig. 3c, vilket kan förklara det dåliga affinitetsvärdet som förutsägs av AutoDock Vina. Detta studiefall har införlivats som en handledning i användarmanualen, som ingår i AMDocks installationsmapp, och i wikin på Github (https://github.com/Valdes-Tresanco-MS/AMDock-win/wiki/4.3-Off-target-docking).

Diskussion

AMDock tillhandahåller ett nytt, lättanvänt och mångsidigt gränssnitt för att arbeta med två molekylära dockningsmotorer, Autodock4 och Autodock Vina, som har olika funktionaliteter och egenskaper. AMDock bör vara mycket användbart för forskare med liten erfarenhet av att arbeta med dockningsprogram eftersom det inte behövs någon tidigare kunskap om hur dessa program särskilt fungerar. Tre olika arbetsflöden (enkel dockning, off-target-dockning och poängsättning) ingår i AMDock-miljön. Vi anser att off-target-dockingförfarandet är särskilt användbart för att genomföra studier av ligandens selektivitet – ett kritiskt steg i processen för läkemedelsdesign.

Förberedelse av inmatningsfilerna på ett korrekt och konsekvent sätt, liksom korrekt definition av sökutrymmet, är kritiska frågor när man utför molekylära dockningsstudier. Flera externa program/skript är integrerade i AMDock för att göra det möjligt att förbereda inmatningsfilerna med minimal ansträngning samtidigt som man behåller kontrollen över processen. AMDock använder OpenBabel och PDB2PQR för ligand- respektive receptorprotonering, medan de andra GUI som nämns i inledningen använder ADT för både receptor- och ligandprotonering (med undantag för DockingApp, som också använder OpenBabel för ligandprotonering).

För att definiera sökutrymmet erbjuder AMDock flera alternativ för att ställa in positionen för rutnätboxen i olika scenarier, medan den inmatade liganden används som standard för att bestämma boxens optimala dimensioner, vilket minskar beräkningskostnaden samtidigt som man optimerar dockningsprocessen . I detta avseende är det bara ADT och PyMOL/AutoDock-pluginet som erbjuder vissa begränsade alternativ förutom ett användardefinierat sökutrymme, men i vilket fall som helst måste boxstorleken definieras av användaren. I vissa av dessa grafiska gränssnitt, som i DockingApp, täcker sökutrymmet hela receptorn, vilket leder till ytterligare beräkningskostnader och eventuellt äventyrar simuleringarnas noggrannhet. Med andra GUI måste användaren använda ett externt program, t.ex. ADT, för att definiera boxparametrarna.

Valet ”Centered on Residue(s)” är att föredra när bindningsplatsresterna är kända. Med det här alternativet genereras ett objekt som placeras i det geometriska centrumet av de valda resterna med AutoLigand på proteinytan. Detta förfarande optimerar både placeringen och storleken på sökutrymmet. Om rutan i stället var centrerad på det geometriska centret för de utvalda resterna kommer en betydande del av den sannolikt att vara inbäddad i proteinet, vilket kräver en större storlek för att täcka det nödvändiga provtagningsutrymmet (fig. 4). Alternativet ”Centered on Hetero” är användbart för redockingstudier av komplex med kristallografiska strukturer eller när man studerar ligander med liknande bindningssätt (fig. 2b). Alternativet ”Automatic” är å andra sidan önskvärt när ingen information om bindningsstället finns tillgänglig. I detta fall utförs en oberoende dockingkörning för varje bindningsplats som förutsägs av AutoLigand (fig. 2d). På så sätt kombineras informationen från AutoLigands rangordningsmetod med den från dockningsmotorn, utan att man gör ett godtyckligt val av en av de förutspådda platserna. Denna process sker automatiskt och resultaten för var och en av de förutspådda bindningsplatserna kan visualiseras i PyMOL. Sammantaget innebär definitionen och visualiseringen av boxen en minimal ansträngning och kan alltid ändras, vilket utgör en fördel inte bara för nybörjare utan även för experter.

Det är värt att notera att vi standardiserade boxstorleken till att vara i Angström för att undvika vanligt förekommande fel, som rapporterats i olika forum och mailinglistor. Dessa fel beror på de olika sätt på vilka boxdimensionerna definieras i AutoDock (antal punkter + rutnätsavstånd) och Autodock Vina (i angström), och kan leda till att sökutrymmet blir mycket litet eller för stort, vilket i slutändan leder till inkonsekvenser i de erhållna dockningsresultaten.

Integreringen av AMDock med PyMOL utgör en betydande fördel. PyMOL är faktiskt en mycket använd molekylär tittare med stort samhällsstöd och aktiv utveckling. Inom PyMOL kan dockningsresultaten analyseras med flera verktyg, särskilt med den kraftfulla Protein-ligand Interaction Profiler . Andra program som ADT, PyRx eller DockingApp har sina egna grafiska tittare. PyRx och DockingApp erbjuder enkla lösningar med begränsade analysmöjligheter, medan ADT endast tillåter enkel analys av protein-ligandinteraktioner.

Det är dessutom möjligt att med AMDock starta dockningssimuleringar för metalloproteiner med hjälp av AutoDocks Zn-kraftfält, som i ADT endast är tillgängligt via kommandoraden. Dess off-target-dockningsalternativ, som är mycket användbart för studier av läkemedelsomläggning, är endast tillgängligt i Dockomatic och PyRx (i den senare endast i betalversionen).

De flesta av de grafiska användargränssnitten för dockning är inriktade på virtuell screening. För närvarande har AMDock inte stöd för virtuell screening, men vi arbetar för närvarande på dess implementering, för att göra det tillgängligt i nästa programversion.

Slutligt, och eftersom ADT förmodligen är det mest använda docknings-GUI:t, ger vi en mer detaljerad jämförelse mellan AMDock och ADT (tabell 1).

Slutsatser

AMDock är ett användarvänligt GUI som fungerar på ett mycket intuitivt och interaktivt sätt, vilket gör det möjligt att utföra molekylära dockningsstudier med Autodock4 och AutoDock Vina med en minimal installationsinsats. Dessa egenskaper gör AMDock till ett attraktivt verktyg även för undervisningsändamål. AMDock samlar funktioner och förfaranden som inte finns i andra liknande program. Det inkluderar den senaste utvecklingen inom AutoDock, t.ex. parameteriseringen Autodock4Zn. För vår grupp har AMDock varit mycket användbart för att uppskatta selektivitetsprofilen för olika PI3K-hämmare över ortologiska proteiner i flera mikroorganismer. Ytterligare utveckling (hydrerad ligand, kovalent dockning och virtuell screening) kommer att inkluderas som dockningsalternativ i framtida versioner.