Cellinjer
Cellinjerna och deras källor är följande: 293T (ATCC CRL-11268), 786-O (ATCC CRL-1932) och HK-2 (ATCC CRL-2190). THP-1-celler tillhandahölls vänligen av Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences. Cellerna odlades i DMEM (för 293T och 786-O), MEM (för HK-2) eller RPMI 1640 (THP-1) medium med 10 % serum från fetalt nötkreatur och 2 mM l-glutamin, vid 37 °C i närvaro av 5 % CO2. Före infektion med bakterier, behandling med proteiner eller kemotaxisanalys byttes mediet till serumfritt medium.
Bakteriestammar och plasmider
Bakteriestammarna och plasmiderna som användes i den här studien anges i kompletterande tabell S3. E. coli-stammar odlades vid 37 °C i Luria-Bertani (LB)-medium under statiska förhållanden i 12 timmar med lämpliga antibiotika vid behov, i följande koncentrationer: Kanamycin 50 μg/ml, ampicillin 100 μg/ml och kloramfenikol 15 μg/ml. ΔhlyA-stammen genererades genom att hlyA ersattes med en cat-gen med hjälp av λ-Red-rekombinas. För att generera ∆hlyA p-hlyA-stammen amplifierades hlyA-genen genom PCR från kromosomen hos UPEC-stammen CFT073 och ligerades till pTRC99A vid KpnI- och XbaI-enzymställena, och plasmiden transformerades till ∆hlyA genom elektroporation. HlyC- och hlyA-generna från CFT073 eller det komplementära DNA (cDNA) som kodar för Nectin-2 amplifierades genom PCR och klonades in i pET-28a ( + ) för att producera aktiva FLAG- eller HA-märkta HlyA- eller Nectin-2-rekombinanta proteiner. För att producera inaktivt FLAG-märkt HlyA (pro-HlyA) klonades hlyA-genen utan hlyC från CFT073 in i pET-28a ( + ) vid XbaI- och XhoI-enzymställena. Myc-märkt Nectin-2 integrerades i pLenti-Hygro-vektorn för transfektion.
Expression och rening av rekombinant protein från HlyA, pro-HlyA och humant Nectin-2
Expression av rekombinant HlyA eller pro-HlyA utfördes i E. coli BL21 (DE3), och uttryck av Nectin-2 utfördes i Rosetta (DE3). Före induktion med 100 μM IPTG odlades bakterierna vid 37 °C tills de nådde en OD600 på 0,6-0,8. De odlade bakterierna samlades upp genom centrifugering (8000 × g i 5 minuter vid 4 °C) efter 12 timmars induktion vid 16 °C i LB med IPTG. Bakterierna lyserades med lysozym och ultraljud och supernatanten centrifugerades för att avlägsna partiklar (18 000 × g i 30 minuter vid 4 °C). Proteinerna renades sedan med hjälp av Ni-NTA Purification System (GenScript, Nanjing, Kina). Proteinerna eluerades med 250 mM imidazol. Fraktioner med HlyA-fragmenten sammanfördes, dialyserades i 150 mM imidazol, 50 mM imidazol och två gånger med PBS. Därefter koncentrerades fraktioner som innehöll det önskade proteinet till 500 μl med hjälp av Amicon Ultra-15 centrifugalfilterenheter (Millipore, Burlington, MA, USA). Den sista dialysbufferten som hade en liknande jonisk miljö som det renade HlyA-proteinet användes som kontroll för det renade proteinet i experimenten. Den slutliga proteinkoncentrationen bestämdes spektrofotometriskt (Nanodrop-2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) med hjälp av BCA Protein Assay Kit (23225, Thermo Scientific).
Mus pyelonefritmodell
Alla djurstudier granskades och godkändes av kommittén för vård och användning av djur vid Tianjin Medical University, Tianjin, Kina. Vi gjorde allt för att minimera djurens lidande och minska antalet använda djur. C57BL/6J-möss av honkön, 6-8 veckor gamla, köptes från Academy of Military Medical Science (Beijing, Kina). Musmodellen för akut pyelonefrit upprättades enligt tidigare beskrivning.53 Bakterierna odlades över natten i statiskt LB-medium vid 37 °C. De odlade bakterierna pelleterades genom centrifugering (5000 × g i 5 minuter vid 4 °C) och resuspenderades i PBS för att få en densitet på 2 × 1010 CFU/ml. Med 3 timmars mellanrum inokulerades sövda kvinnliga C57BL/6J-möss intrauretralt med 50 μl UPEC-stammar (109 CFU) två gånger.54,55 Vid 12, 24 och 48 hpi offrades mössen och njurarna avlägsnades aseptiskt och homogeniserades i 1 ml PBS som innehöll 0,025 % Triton X-100 och späddes sedan seriellt för bakterietäthet. Vid 24 hpi användes njurvävnaderna också för flödescytometri, histologi och analys av proinflammatoriska cytokiner.
Flödescytometrianalys
Encellssuspensioner genererades genom nedbrytning med 1,5 mg/ml kollagenas IV (C5138, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) och 100 ng/ml DNas I i PBS i 30 minuter vid 37 °C under lätt skakning. De digererade cellsuspensionerna filtrerades sedan genom en 70-μm cellfilter (352350, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) för att erhålla singelcellssuspensioner. Fc-receptorer blockerades med CD16/32 (101319, Biolegend, San Diego, CA, USA) och de enskilda cellsuspensionerna inkuberades sedan med följande antikroppar: Anti-CD11b konjugerad till APC (17-0112-82, Thermo Fisher Scientific), anti-Ly6G konjugerad till PE (127608, Biolegend), anti-F4/80 konjugerad till FITC (11-4801-82, Thermo Fisher Scientific), anti-CD11c konjugerad till PE (127608, Biolegend), anti-CD206 konjugerad till PerCP/Cy5.5 (141716, Biolegend). Cellerna analyserades på en FACSCanto II flödescytometer (BD Biosciences) med hjälp av mjukvaran Flow Jo (FlowJo, Ashland, OR, USA).
H&E-färgning och immunohistokemi
Njurarna fixerades i 10 % fosfatbuffrad formalin i minst 24 timmar. Den fixerade vävnaden bäddades sedan in i paraffin och skars ut i 5 μm långa snitt. Objektglasen färgades med hematoxylin och eosin. Renala histopatologiska förändringar bedömdes med hjälp av en 6-gradig skala där 0, 1, 2 och 3 indikerade normala, lätta, måttliga och allvarliga histologiska skador (den patologiska skadan var huvudsakligen lokaliserad i märgen och den kortikala-medullära övergången), medan 4, 5 och 6 indikerade lätta, måttliga och allvarliga histologiska skador (den patologiska skadan var huvudsakligen lokaliserad i fler delar av njuren). Histologiska undersökningar analyserades av två personer som var blinda för försöksgrupperna.56,57 För immunohistokemisk analys färgades sektionerna med anti-Nectin-2 antikropp (27171-I-AP, 1:200, Proteintech, Chicago, IL, USA). Bilderna togs i mikroskop (BX46, Olympus, Tokyo, Japan).
Immunofluorescensanalys av vävnader och celler
Njurarna bäddades in i OCT-förening med flytande kväve. Frysta block skars i 5-µm sektioner och lufttorkades i rumstemperatur i 1 timme och fixerades med kall aceton i 10 minuter. De frysta sektionerna sänktes sedan omedelbart ner i metanol i 20 min och därefter metanol med 3 % väteperoxid i 10 min. Vävnaderna blockerades med 5 % bovint serumalbumin (BSA) i 1 timme, inkuberades med anti-F4/80-antikropp (ab6640, Abcam, 1:200), anti-Ly6G-antikropp (ab210402, Abcam, 1:200), Nectin-2-antikropp (ab135246, Abcam, 1:200) i blockeringsbuffert över natten vid 4 °C när så krävs. Objektglasen tvättades sedan fem gånger med PBS och inkuberades med Alexa Fluor 488/549-märkta sekundära antikroppar (Proteintech, 1:200) i 1 timme i rumstemperatur. För visualisering av kärnor kontrafärgades vävnadssektionerna med DAPI. Bilderna togs i ett fluorescerande mikroskop (IX73, Olympus). De 293T-celler som transfekterats med pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 odlades på ett Lab-Tek kammarlockglas och behandlades med 75 nM HlyA i 6 h, fixerades med 4 % paraformaldehyd i 15 min och utsattes för immunofluorescensfärgning med anti-MYC-Tag-antikropp (66003-2-Ig, 1:25, Proteintech) och HA-Tag-antikropp (2367S, 1:200, CST) vid 4 °C över natten. Alexa Fluor 488/594-märkt andra antikropp (Proteintech) användes genom inkubering i rumstemperatur i 1 h. Cellerna avbildades med hjälp av ett konfokalt fluorescensmikroskop (FV1000-D, Olympus).
Infektion av njurepitelceller med UPEC-stammar
Mänskliga njurepitelceller (786-O eller HK-2) såddes i 24-hålsplattor, 24 h före UPEC-infektioner. För ADAM10-hämning preinkuberades cellerna med ADAM10-hämmaren GI254023X (Sigma-Aldrich) i 20 timmar före infektionerna. Cellerna infekterades med bakterier med angiven infektionsmultiplicitet (MOI) i 6 timmar eller stimulerades med de angivna koncentrationerna av renad HlyA eller pro-HlyA i 12 timmar. I vissa experiment behandlades cellerna med ∆hlyA (MOI 0.01) spetsade med renad HlyA (75 nM) i 6 h. För invasionsanalysen tvättades cellerna efter 6 h infektion fem gånger med PBS och behandlades med 200 μg/ml gentamicin i 1 h för att döda extracellulära bakterier. Cellerna tvättades sedan två gånger med PBS och lyserades med 500 μl 0,2 % triton X-100 i PBS och utplacerades på LB-agarplattor för att räkna de intracellulära bakterierna.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
GM-CSF-nivåer i supernatanten från infekterade 786-O-celler, HlyA/pro-HlyA-behandlade 786-O-celler eller homogeniserade njurar efter infektion mättes med hjälp av ett ELISA-utvecklings-kit (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, Kina) enligt tillverkarens instruktioner. Musens njurar avlägsnades och homogeniserades i PBS som innehöll 1 % Triton X-100 och kompletta mini-EDTA-fria proteashämmarcocktailtabletter (11697498001, Roche, Indianapolis, IN). Homogenaten inkuberades sedan på is i 30 minuter och centrifugerades vid 10 000 × g i 10 minuter vid 4 °C. Supernatanterna samlades upp och användes för ELISA-analys av GM-CSF, IL-1β, TNF-α, IL-6 och MIP-2 enligt tillverkarens instruktion (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, Kina).
Cytotoxicitetsanalyser
Cellodlingssupernatanter från 786-O-celler som behandlats med renade proteiner eller dialysbuffert i 12 timmar samlades in och detekterades för laktatdehydrogenas (LDH) med hjälp av ett CytoTox-96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit (G1780, Promega, Madison, WI, USA).
Urinprover från patienter
Urinprover samlades in från patienter som infekterats av UPEC-stammar som genomgick behandling vid Second Hospital of Tianjin Medical University, och närvaron av hlyA-genen i UPEC-stammen som isolerats från urin från en enskild patient bestämdes genom PCR (kompletterande tabeller S2 och S4). Urinen koncentrerades till 200 μl med hjälp av Amicon Ultra-15 centrifugalfilterenheter (UFC901024, Millipore), och den koncentrerade vätskan detekterades sedan med hjälp av ELISA-utvecklingskit (Neobioscience Technology Company). Studierna i samband med patientprover godkändes av etikkommittén vid Tianjin Medical University, och skriftligt informerat samtycke inhämtades från alla patienter.
RNA-extraktion och qRT-PCR
786-O-celler infekterades med CFT073, ∆hlyA eller ∆hlyA p-hlyA (MOI 0,01) i 4 timmar. RNA extraherades med hjälp av Total RNA Extraction Kit (Solarbio, Beijing, Kina) enligt tillverkarens protokoll och omvänt transkriberades med hjälp av RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific). qRT-PCR utfördes med hjälp av en FastStart Universal SYBR Green Master mix (Roche, Basel, Schweiz) på ett 7900 Fast Real-Time PCR System (Roche). PCR-cykelförhållandena var 95 °C i 5 minuter, följt av 40 cykler av 95 °C i 20 s, 60 °C i 20 s och 72 °C i 20 s. β-actin användes som endogen kontroll och data normaliserades baserat på transkriptionsnivån av β-actin i vildtypen och kvantifierades med hjälp av den komparativa kritiska tröskelcykeln 2-∆∆∆Ct-metoden. De primers som användes anges i kompletterande tabell S4.
Chemotaxis assays
Cellmigrationsanalyser utfördes med hjälp av Transwell-kammare (porstorlek 5 μm, Costar, Corning 3421, Corning, NY, USA). THP-1-cellerna (2 × 106 i 200 μl) återuppsuspenderades i serumfritt RPMI 1640-medium och lades i den övre kammaren. Supernatanten från infekterade 786-O-celler blandades med 1 μg/ml neutraliserande antikropp mot human GM-CSF (502203, BVD2-23B6, Biolegend) eller kontroll-IgG2a (400515, Rat IgG2a, Biolegend) och inkuberades i 30 minuter. Därefter tillsattes 600 μl medium innehållande supernatanten till den nedre kammaren som kemoattraktionsmedel. Efter 3 h eller 6 h inkubation vid 37 °C i en 5 % CO2-fuktad atmosfär räknades de migrerade cellerna i den nedre kammaren.
Clodronatliposomer och behandling med anti-GM-CSF-antikroppar
För att eliminera makrofagerna administrerades 200 µl PBS eller clodronatliposomer till möss intravenöst 24 h före infektion.32,33 För att neutralisera GM-CSF injicerades neutraliserande antikroppar mot GM-CSF (505408, MP1-22E9, Biolegend, 250 µg) eller kontroll-IgG2a (400533, Rat IgG2a, Biolegend, 250 µg) intravenöst till möss 1 timme före infektionen33,58.
Antikroppar och western blotting
Antikroppar erhölls från följande företag: monoklonal anti-FLAG-antikropp (F1804, Sigma-Aldrich), anti-MYC-Tag-antikropp (66004-I-Ig, Proteintech, Chicago, IL, USA) och anti-Nectin-2-antikropp (ab135246, Abcam, Cambridge, Storbritannien). Hela celllysat framställdes med hjälp av RIPA-lysbuffert (Millipore), med fullständiga proteashämmare (Roche, Basel, Schweiz). BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher) användes för att bestämma proteinkoncentrationen. HRP-konjugerat anti-kanin-IgG (1:10000, Sigma-Aldrich) eller anti-mus-IgG (1:10000, Sigma-Aldrich) användes för att avslöja antikroppsbindningen. Immunreaktiva komplex detekterades med Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) och exponerades i en GE Amersham Imager 600-maskin.
Far-western blotting och LC-MS/MS-analys
Far-western blotting-protokollet utfördes enligt tidigare beskrivning.59 786-O-celler tvättades två gånger med iskall PBS, och cellmembranproteinerna isolerades med hjälp av ett kit för extraktion av membran- och cytosolproteiner (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kina) enligt tillverkarens protokoll. Lösliga membranassocierade proteiner analyserades med hjälp av natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores på 10 % geler. Proteinerna överfördes sedan till PVDF-membran (polyvinylidenfluorid) (Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland). De överförda proteinerna renaturerades med hjälp av AC-buffert genom att gradvis minska guanidin-HCl-koncentrationen.59 Därefter blockerades membranet med 5 % skummjölk i TBST-buffert i 1 h. Därefter inkuberades membranet med 30 μg/ml renad FLAG-märkt HlyA eller dialysbuffert över natten vid 4 °C. Efter tvättning inkuberades membranet med 1:1000 utspädd anti-FLAG-antikropp (Sigma-Aldrich) över natten vid 4 °C i 5 % skummjölk i TBST-buffert. Därefter tvättades membranet noggrant och inkuberades med HRP-konjugerat anti-mus IgG (1:10000, Sigma-Aldrich)
De olika banden mellan dialysbuffergruppen och den FLAG-taggade HlyA-gruppen identifierades med hjälp av LC-MS/MS, som utfördes med hjälp av en nanoLC-LTQ-Orbitrap XL-masspektrometer (Thermo, San Jose, CA, USA) kopplad till ett Eksigent nano LC 1D plus HPLC-system i Majorbio (Shanghai, Kina). Tryptiska peptider smältes fullständigt enzymatiskt och joniserades med hjälp av nano-elektrosprayjonisering.33 Data analyserades med hjälp av ett masspektrum med full scan (300 till 1800 m/z). Slutligen användes Proteome Discoverer (version 1.4.0.288, Thermo Scientific) för att analysera MS-data.
RNA-interferens och överuttryck av Nectin-2
Small-interfering RNAs (siRNAs) för de målinriktade generna och ett scrambled control siRNA (siScr) syntetiserades av GenePharma (Shanghai, Kina). SiRNA:erna transfekterades i 786-O- eller HK-2-celler med Lipofectamine 3000 (Invitrogen). pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 transfekterades i 786-O- eller HK-2-celler med Lipofectamine 3000 (Invitrogen) för att överuttrycka Nectin-2. Fyrtioåtta timmar efter transfektionen analyserades cellerna för proteinuttryck med hjälp av Western Blotting. Sekvenserna för siRNA:erna anges i tilläggstabell S4.
Immunoprecipitation
293T-celler transfekterades med pLenti-Hygro-vektorn eller pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 och odlades sedan i 48 timmar. Cellerna inkuberades sedan med FLAG-märkt HlyA (75 nM) i 6 h efter transfektionen och lyserades nyligen i lysisbuffert (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 % NP-40, 0,2 mM EDTA, 150 mM NaCl) för Western Blotting eller immunoprecipitations (IP)-analyser. 786-O-celler inkuberades med FLAG-märkt HlyA (75 nM) eller dialysbuffert i 6 timmar och lyserades sedan med lysisbuffert för protein-IP-analys. Cellsupernatanter inkuberades med anti-FLAG M2-beads (A2220, Sigma-Aldrich) eller anti-Myc M2-beads (A7470, Sigma-Aldrich) i 12 timmar vid 4 °C för FLAG-taggat eller Myc-taggat protein IP. För Nectin-2-protein-IP inkuberades cellsupernatanter med anti-Nectin-2 antikropp (ab135246, Abcam) i 12 timmar vid 4 °C, och sedan inkuberades de med Protein A/G-agaros (20241, Thermo Fisher) i 2 timmar vid 4 °C. Normal kanin IgG (2729S, CST) användes som kontroll. Efter inkubation samlades utfällningarna upp genom centrifugering, tvättades fem gånger med lysisbuffert och analyserades genom immunoblotting med monoklonal anti-FLAG-antikropp, anti-MYC-Tag-antikropp eller anti-Nectin-2-antikropp.
Bakteriellt uttryckt, renad rekombinant FLAG-märkt HlyA (1 µg) inkuberades med 1 μg bakteriellt uttryckt renad rekombinant Nectin-2 i bindningsbuffert (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,1 % Triton-X 100, 100 mM NaCl, 20 % glycerin,1 % BSA) i 12 h. Komplexen utsattes sedan för FLAG-märkt protein-IP eller Nectin-2 protein-IP. Slutligen analyserades de komplexerade proteinerna med hjälp av immunoblotting.
Statistisk analys
Den statistiska betydelsen av skillnaderna mellan grupperna testades med hjälp av variansanalys (ANOVA). Det icke-parametriska Mann-Whitney-testet användes för att beräkna den statistiska signifikansen i in vivo-experimenten.