Tetramisol (Sigma T1512, o soluție stoc de 10 mg/mL în H2O diluată la aproximativ 100 μg/mL în săruri de ou) adăugarea este opțională; acest medicament paralizează viermii și facilitează tăierea. Tăiați imediat: dacă sunt prea contractați, viermii nu ar elibera multe ouă. Folosiți o lamă de bisturiu nouă în fiecare zi, deoarece acestea se corodează rapid. Excesul de tetramisol va duce la formarea unui precipitat în soluția de NaOCl.
Pentru un randament maxim, se pot elibera mai multe ouă prin tratarea viermilor tăiați timp de aproximativ 1 min cu un volum egal de soluție de NaOCl adăugată direct în picătura de tăiere. De îndată ce ouăle sunt eliberate, adăugați același volum de EGM ca și NaOCl utilizat pentru a preveni deteriorarea în continuare a ouălor. Acest tratament va ucide stadiile pronucleare și va deteriora embrionii cu o singură celulă. Tratamentul de 3 minute cu NaOCl este încă necesar înainte de tratarea cu chitinază pentru o digestie uniformă. Pentru ouăle mai devreme de stadiul de două celule, în care coaja este încă oarecum permeabilă, se adaugă un volum egal de EGM imediat ce viermii sunt tăiați. După aceasta, mulți pot supraviețui celor 3 minute de tratament cu NaOCl și chitinază, iar unii vor fi încă în stadiul de o celulă după tratamentul cu chitinază și îndepărtarea învelișului vitelin, dacă lucrați rapid.
Pipilele de transfer satisfăcătoare sunt realizate din capilare SMI micropipettor de 5 până la 30 μL (Fisher 21-380-9C) sau capilare World Precision Instruments de 4 inci (1B100F-4), prin tragere dublă peste o flacără foarte mică. Acest lucru se face mai întâi prin încălzirea și tragerea ușoară pentru a realiza o secțiune centrală subțire, apoi prin răcire scurtă și apoi prin reîncălzire mai ușoară, menținând capilarul sub tensiune pentru tragerea finală. Tragerea ideală produce o pipetă cu un tijă distinctă și o secțiune îngustă care se îngustează treptat de aproximativ 3/4-1 inch. Un mic arzător cu gaz poate fi realizat prin montarea unui ac de seringă mare într-un dop de plută, cu o clemă cu șurub pe tubulatură pentru a regla debitul de gaz. Alternativ, pipetele de dimensiuni consistente pot fi realizate prin tragere pe un extractor automat. Înainte de utilizare, rupeți capilarul până la vârful dorit, aproximativ 100-150 μm (de trei sau patru ori diametrul oului) prin ciupire între unghia degetului mare și vârful degetului sau folosind o lamă de ras sub un microscop de disecție. Un microscop Microforge poate ajuta la realizarea unor pipete consistente, deși nu este necesar. Păstrați diametrul mic al pipetei pentru a minimiza transferul de lichid. În cazul în care ouăle se lipesc de interiorul pipetei, multe dintre ele pot fi recuperate prin spălare cu soluție de NaOCl sau cu EGM pe parcurs. Așteptați-vă să schimbați frecvent pipetele și pregătiți o rezervă bună înainte de o sesiune de lucru.
Dacă digestia cu chitinază nu funcționează în 8 minute, probabil că nu va funcționa deloc. Cele mai frecvente probleme sunt reprezentate de hipoclorit sau de starea fiziologică a viermilor (prima zi de ouat pare să dea ouă mai tari). Hipocloritul ar trebui să fie un lot neexpirat și, de obicei, devine slab cu aproximativ o lună înainte de data de expirare. Păstrați stocul la frigider într-o sticlă închisă la culoare și aerisită, umplută până aproape de vârf. Amestecați un tub de 3 ml chiar înainte de a începe și păstrați-l la gheață; acesta va funcționa timp de aproximativ 3 h și apoi trebuie înlocuit.
După tratamentul enzimatic și mai ales după permeabilizare, embrionii sunt destul de lipicioși și se vor aglomera; acest lucru poate fi redus la minimum prin pipetarea unuia sau doar a câtorva la un moment dat. Micile aglomerări pot fi sparte prin expulzarea din pipetă cu puțină forță de câteva ori.
Pipetările de permeabilizare sunt trase manual în același mod ca și pipetele de transfer, folosind capilare de injecție Kwik-fil (1B100F-4 de la World Precision Instruments). Firul interior poate ajuta la tăierea învelișului vitelinian. Tragerea ideală oferă o conicitate lungă și treptată în secțiunea subțire, astfel încât aceasta să poată fi tăiată la diametrul dorit. Pipele se taie cu o lamă de bisturiu proaspătă pe Parafilm sub microscopul de disecție. Se poate realiza un adaptor pentru pipeta de gură cu un tub Tygon cu diametru mic, filetat pe un ac de seringă atașat la un tub de gură. Se umple vârful pipetei cu EGM până la orificiul mai larg și se testează pe primul lot de embrioni chitinazați; se taie din nou vârful pipetei dacă acesta este prea mic. Dimensiunea ideală va varia în funcție de vârsta embrionului pe care încercați să îl obțineți; stadiile foarte timpurii sunt mai fragile și au nevoie de un orificiu puțin mai mare; embrionii mai mari de opt celule se comprimă cu mai puține daune și vor ieși adesea din pipete mai mari cu învelișul vitelinic intact. Astfel de embrioni nepermeabilizați vor continua să se dezvolte până la stadiul de ecloziune.
Utilizați o seringă pe pipeta cu gură pentru umplerea și curățarea pipetelor de permeabilizare; permeabilizarea propriu-zisă se face prin presiunea aerului din gură. Pipete pot sta în aer timp de mai multe ore fără să se usuce, deoarece orificiul este foarte mic, dar pe măsură ce se usucă se vor înfundă în cele din urmă. Păstrați pipetele (una bună merită păzită și va dura câteva săptămâni) prin spălarea vârfului de mai multe ori cu apă distilată și suspendarea vârfului pipetei într-un tub de apă distilată sterilă sau HCl 0,1 M, folosind un „steguleț” de bandă adezivă pe pipetă pentru ca aceasta să nu se scufunde complet.
Dacă pipeta este potrivită, este nevoie de doar câteva minute pentru a permeabiliza un lot de embrioni prin aspirarea individuală a acestora în pipetă și expulzarea lor ușoară. Ei vor ieși mai mult sau vor fi mai puțin comprimați în funcție de diametrul interior al pipetei, dar se vor rotunji din nou în câteva minute. Dacă există multă liză la permeabilizare, fie că digestia a fost incompletă, fie că orificiul pipei a fost prea mic. Deoarece membranele celulare sunt destul de labile timp de 4-5 minute după începerea citocinezei, embrionii devitelinizați în timpul și imediat după clivaj se pot liza sau blastomerele pot fuziona, suferind ulterior un clivaj tetrapolar anormal. Dacă este critic, verificați în timpul unui experiment și eliminați astfel de embrioni.
O geană foarte fină (un instrument tradițional de microscopie electronică) montată pe o scobitoare cu lipici este cel mai satisfăcător instrument pentru separarea manuală rapidă a blastomerilor; un ac de sticlă funcționează, de asemenea, dar se rupe ușor. Genele pot fi curățate cu alcool și un șervețel. Blastomerii se vor liza dacă sunt separați imediat după o diviziune; 5-10 min după clivaj este cel mai bun moment pentru manipulări reușite, cu excepția cazului în care aveți nevoie de separări mai devreme. Separările AB/P1 sunt cele mai ușoare. Embrionii cu patru celule pot fi, de asemenea, separați. Alternativ, pentru a obține blastomeri P2 și EMS, P1 poate fi separat după prima diviziune și EMS/P2 după a doua. Blastomerii din linia P pot fi recunoscuți după dimensiunea relativă și dispunerea lor liniară. Cu un randament scăzut, MS, E, P3 și C pot fi separate din cei patru descendenți ai unui blastomer P1 izolat inițial. Identificările celulare făcute pe baza dimensiunii celulelor pot fi confirmate prin examinarea perioadelor distincte ale ciclului celular.
.