Drosophila lines
Câteva linii (GMR57C10-Gal4, elav-Gal4, UAS-GCaMP6s, UAS-GCaMP6f, UAS-CD4:tdGFP, și UAS-tdTomato) au fost obținute de la Bloomington Stock Center. MAN-Gal4 (VT50660-AD; VT14014-DBD) și MDN-1-Gal4 (VT44845-DBD; VT50660-AD) au fost furnizate de B. Dickson (Janelia Research Campus). DNa01-Gal4 (SS00731: GMR22C05-AD; GMR56G08-DBD), DNb06-Gal4 (SS02631: GMR20C04-AD; BJD113E03-DBD), DNg13-Gal4 (SS02538: BJD118A10-AD; BJD123E03-DBD) și DNg16-Gal4 (SS01543: BJD104A07-AD; BJD107F12-DBD) au fost furnizate de G. Rubin (Janelia Research Campus).
Generarea construcției Act88F:Rpr și a muștelor
Cepele Actin88F:Rpr (muștele Act88F:Rpr) au fost generate folosind o construcție Actin88F:eGFP29. Linia Act88F:GFP, care găzduiește o construcție eGFP condusă de o regiune de 2053 bp a promotorului actin88F, a fost obținută de la R. Benton (Universitatea din Lausanne). O construcție Act88F:Rpr a fost generată utilizând mai întâi următoarea pereche de amorsă, pentru a adăuga un situs de restricție KpnI la capătul 5′ al unei clone de ADNc rpr (IP02530, Drosophila Genomics Resource Center, Bloomington, IN) și un situs XbaI la capătul 3′ al cadrului de lectură deschis, prin intermediul unui kit de mutageneză dirijată de situs QuikChange (Agilent Technologies):
Primitor înainte 5′ AGACGGTACCATCCATGGCAGTGGGGCATTC 3′
Primitor invers 5′ GCCGCGTCTAGATCATTGCGATGGCTT 3′
Construcția Rpr a fost apoi îmbinată în Act88F:eGFP în spatele promotorului Act88F în locul secvenței eGFP. Construcția Act88F:Rpr a fost injectată în embrioni de Drosophila attp18 pentru transgeneză specifică de situs mediată de integraza PhiC3135 (situs de aterizare a transgenei citolocalizarea 6C12) de către BestGene Inc. (Chino Hills, California). Pentru unele experimente, această transgenă a fost combinată cu UAS-GCaMP6s-p2A-tdTomato (generată în laboratorul lui M.H.D.).
Imagistica prin fluorescență a mușchilor de zbor indirect
S-a efectuat microscopia fluorescentă a hemi-toracelor36,37. Pe scurt, muștele au fost anesteziate și apoi li s-au îndepărtat capul și abdomenul. Toracele au fost fixate peste noapte în paraformaldehidă 4% la 4 °C și clătite în soluție salină tamponată cu fosfat 1× (PBS) în ziua următoare. Specimenele au fost așezate pe o lamelă de sticlă, congelate instantaneu în azot lichid și tăiate în două în planul sagital mijlociu cu ajutorul unei lame de ras. IFM-urile au fost colorate cu Alexa-Fluor 568 Phalloidin (1:100 în PBS cu 0,1% Triton-X (PBST)) peste noapte la 4 °C, clătite cu PBS și vizualizate cu ajutorul EVOS® FL Cell Imaging System (Life Technologies) la mărire ×4. Pentru imagistica de montare integrală a miofibrilelor IFM, muștele au fost pregătite și toracolele au fost secționate în două, așa cum s-a descris mai sus. Hemitoracele au fost colorate cu Alexa-Fluor 568 Phalloidin (1:100 în PBST) peste noapte la 4 °C. Probele au fost clătite în PBS, montate cu Vectashield (Vector Laboratories) și vizualizate cu ajutorul unui microscop confocal Leica TCS SPE RGBV (Leica Microsystems) la o mărire de 100x.
Imagistica de imunofluorescență a creierului și a corzilor nervoase ventrale
Creierul și CNV au fost disecate de la muște femele de 2-3 dpe în PBS. Țesuturile au fost apoi fixate timp de 20 min în paraformaldehidă 4% în PBS la temperatura camerei. După fixare, creierele și VNC-urile au fost spălate de 2-3 ori în PBS cu 1% Triton-X-100 (PBST) timp de 10 minute fiecare și apoi incubate la 4 °C peste noapte în PBST. Probele au fost apoi plasate în PBST cu 5% ser normal de capră (PBSTS) timp de 20 de minute la temperatura camerei. Acestea au fost apoi incubate cu anticorpi primari (iepure anti-GFP la 1:500, Thermofisher RRID: AB_2536526; șoarece anti-Bruchpilot/nc82 la 1:20, Developmental Studies Hybridoma Bank RRID: AB_2314866) diluați în PBSTS timp de 48 h la 4 °C. Creierele și VNC-urile au fost clătite de 2-3 ori în PBST timp de 10 min fiecare înainte de incubarea cu anticorpi secundari (anticorp secundar de capră anti-rabie conjugat cu Alexa 488 la 1:500; Thermofisher; anticorp secundar de capră anti-șoarece conjugat cu Alexa 633 la 1:500; Thermofisher) diluat în PBSTS timp de 48 h la 4 °C. În cele din urmă, creierele și VNC-urile au fost clătite de 2-3 ori timp de 10 min fiecare în PBST și au fost montate pe lamele cu capac bridge în Slowfade mounting-media (Thermofisher).
Eșantioanele au fost imaginate cu ajutorul unui microscop confocal cu scanare laser Carl Zeiss LSM 700 cu următoarele setări: mărire ×20, interval dinamic de 8 biți, medie a imaginii de 2×, dimensiune a pixelilor de 0,52 × 0,52 μm, interval de 0,57 μm pentru pasul z. Proiecțiile z cu deviație standard ale volumelor de imagistică au fost realizate cu ajutorul Fiji38. Pentru a compara expresia GFP în sistemul nervos central, intensitatea laserului și câștigurile PMT pentru canalul verde au fost menținute constante în eșantioanele de tip sălbatic, A1 > GFP și Act88F:GFP.
Imaginea expresiei GFP în mușchii picioarelor
Picioarele au fost disecate manual la nivelul articulației corp-coxa și montate pe lame de sticlă cu ajutorul benzii dublu-adezive. Apoi, în spațiul dintre lamelă și diapozitiv s-a adăugat mediul de montare Slowfade (Thermofisher). Apoi am înregistrat fluorescența GFP în canalul verde cu ajutorul unui microscop confocal cu scanare laser LSM 700 (Zeiss). Intensitatea laserului, câștigurile PMT și parametrii de scanare au fost menținute constante la animalele de tip sălbatic, MHC > GFP și Act88F:GFP: mărire ×20, interval dinamic de 8 biți, medie a imaginii ×8, dimensiune a pixelului de 0,63 × 0,63 µm și interval de 10 µm pentru pasul z. Autofluorescența cuticulară a fost, de asemenea, înregistrată în canalul roșu.
Disecția toracică pentru imagistica VNC
Suporții personalizați utilizați pentru a monta muștele în timpul imagisticii au fost fabricați așa cum au fost descriși anterior39. Pentru imagistica VNC, aceste platouri au fost modificate pentru a avea (i) șaibe de oțel plate, mai degrabă decât pliate, și (ii) vârfuri șanfrenate pentru a face banda de rulare sferică vizibilă pentru senzorii de flux optic (Shapeways, „file”). Șaibele din oțel au fost fabricate din oțel inoxidabil de 0,001″, tip 316 recopt moale (McMaster-Carr, piesa nr. 21317K11). Calele au fost gravate (Etchit, Buffalo, MN) pentru a genera găuri dreptunghiulare, după cum se explică „aici”. Fișierul de proiectare a șaibelor poate fi găsit „aici”.
Toate experimentele au fost efectuate pe muște femele de 1-3 dpe crescute la 25 °C cu hrană standard din făină de porumb într-un ciclu de 12 h lumină:12 h întuneric. Muștele au fost anesteziate la 4 °C. S-a selectat o muscă femelă și, în unele cazuri, i s-au tăiat aripile pentru a simplifica procesul de montare. Toracele dorsal al muștei a fost apoi împins printr-o gaură în colacul de oțel al etapei de imagistică. Scena a fost apoi răsturnată, iar lipiciul cu polimerizare UV (Bondic, Aurora, ON Canada) a fost aplicat cu grijă în jurul perimetrului toracelui și polimerizat prin iluminare UV (LED-200, Electro-Lite Co. Bethel, CT, SUA). A fost apoi folosit adeziv UV pentru a fixa capul și abdomenul pe partea inferioară a scenei. Scena a fost apoi umplută cu soluție salină extracelulară18. Sub un microscop de disecție cu putere mare de mărire (Leica M165C), s-a folosit un ac hipodermic (30 G, BD PrecisionGlide, Franklin Lakes, NJ, SUA) pentru a tăia și a ridica cuticula de pe toracele dorsal40 , având grijă să nu se taie conectivul gâtului. Ulterior, la animalele non-Act88F:Rpr, s-a folosit o pereche de pensete ascuțite pentru a îndepărta IFM-urile, cu precădere din regiunea anterioară-medială a toracelui care acoperă intestinul (acest pas nu este necesar la animalele Act88F:Rpr). Acest proces expune suprafața dorsală a proventriculului – o structură intestinală bulboasă mare. Cu mare grijă, s-a folosit apoi o pereche de forceps superfin pentru a prinde și ridica proventriculul pentru a deplasa o mare parte din intestin (inclusiv cultura și glandele salivare) de țesutul nervos situat mai ventral. Cu intestinul astfel ridicat, s-a folosit o foarfecă de tăiat ultrafină (Fine Science Tools, Foster City, CA, SUA) pentru a-l secționa în secțiunea cea mai anterioară. Apoi, proventriculul a fost îndepărtat și s-a făcut o incizie posterioară pentru a îndepărta complet aceste porțiuni de intestin, dezvăluind țesutul nervos subiacent. În special, această disecție îndepărtează, de asemenea, aorta, restricționând fluxul de hemolimfă din vasul abdominal dorsal. Cu toate acestea, am constatat că muștele au fost viabile și s-au comportat timp de până la 4 h. În unele cazuri, am observat că țesutul intestinal sau muscular începea să ascundă VNC în timpul imagisticii. Prin urmare, țesutul liber ar trebui îndepărtat în acest stadiu, având mare grijă să nu se secționeze VNC. După fiecare disecție, am examinat măsura în care animalul și-a mișcat picioarele ca răspuns la un suflu de aer sau a apucat un obiect cu fiecare dintre picioare. Acest lucru s-a dovedit a fi un indicator precis al succesului pregătirii. Pentru a evalua calitatea unei disecții, am examinat mișcările fiecărui picior pe banda de alergare sferică. Dacă o muscă putea să meargă într-un mod coordonat, disecția a fost considerată reușită. În caz contrar, animalul a fost clasificat ca având o deficiență de mișcare a membrelor. Animalele cu mai multe picioare disfuncționale au fost categorisite ca fiind incapabile.
Microscopie cu 2 fotoni în timpul comportamentului
Experimentele au fost efectuate în timpul Zeitgeber time (Z.T.) de seară, iar animalele au fost de obicei imaginate la 30-60 de minute după disecție. Suporturile pentru muște au fost fixate pe o platformă ridicată peste banda de alergare sferică (Fig. suplimentară 3a). VNC a fost apoi localizat cu ajutorul ocularelor microscopului și poziționat în centrul câmpului de vizualizare prin imagistică cu 2-fotoni.
Banda de alergare sferică este o tijă de aluminiu cu o gaură în formă de bilă frezată la un capăt22. Am fabricat bile de spumă cu diametrul de 10 mm (Last-A-Foam FR-7106, General Plastics, Burlington Way, WA, SUA) și le-am reperat manual cu ajutorul unui stilou Rapidograph (Koh-I-Noor, Leeds, MA, SUA) pentru a oferi caracteristici cu contrast ridicat pentru măsurătorile fluxului optic. Un flux de 500-600 ml min-1 de aer filtrat și umidificat a trecut prin suport cu ajutorul unui controler de debit digital (Sierra Instruments, Monterey, CA, SUA). Mișcările mingii au fost măsurate cu ajutorul a doi senzori optici de debit (ADNS3080) dotați cu lentile cu zoom (Computar MLM3X-MP, Cary, NC SUA). Mingea și musca au fost iluminate cu ajutorul unei perechi de LED-uri IR (lungime de undă maximă de 850 nm) cuplate la fibre optice și lentile colimatoare (ThorLabs, Newton, NJ, SUA). Măsurătorile fluxului optic au fost transmise către o placă de microcontroler (Arduino Mega2560) pentru a fi înregistrate cu ajutorul unui cod Python personalizat. În același timp, au fost efectuate înregistrări video ale animalelor care se comportau pe minge cu ajutorul unei camere firewire sensibile la infraroșu (Basler, Ahrensburg, Germania) la aproximativ 30 fps.
Am efectuat microscopie 2-foton folosind un microscop Bergamo II (ThorLabs) echipat cu doi detectori GaAsP PMT pentru imagistica GCaMP6 și tdTomato și cuplat la un laser Ti:Sapphire (MaiTai DeepSee, Newport Spectra-Physics, Santa Clara, CA SUA) acordat la 930 nm. Am utilizat o lentilă obiectiv Olympus 20× cu imersie în apă cu 1,0 NA (Olympus, Center Valley, PA, SUA). Microscopul a fost controlat cu ajutorul software-ului ThorImage (ThorLabs). Experimentele de imagistică a secțiunii coronale au fost efectuate în modul de imagistică Galvo-Galvo la 6-9 Hz. Această frecvență a cadrelor a variat în funcție de dimensiunea imaginii, care a variat între 26,58 × 26,58 µm și 53,15 × 53,15 µm. Puterea laserului a variat între 3 mW și 5,7 mW. Imagistica volumetrică este, de asemenea, posibilă cu hardware adecvat (de exemplu, scanerul Galvo-Resonanță și gulerul obiectivului cu acționare piezoelectrică).
Ocazional, a fost folosit un suflu de aer pentru a provoca comportamente de mers. Aceste suflări au fost codificate digital (Honeywell AWM 3300 V, Morris Plains, NJ SUA). Software-ul ROS personalizat ROS interfațat prin intermediul unui dispozitiv de ieșire analogică (Phidgets, Calgary, Canada) cu software-ul ThorSync (ThorLabs) a fost utilizat pentru a sincroniza măsurătorile fluxului optic, videografia comportamentală, măsurătorile suflului de aer și achiziția de imagini 2-fotonice. Pentru imagistica secțiunii coronale, s-a folosit un guler Piezo (Physik Instrumente, Karlsruhe, Germania) pentru a controla mișcările rapide pe axa z ale obiectivului microscopului.
Pentru a compara activitatea neuronală între animalele de control și cele cu Act88F:Rpr, am achiziționat imagini de 512 × 512 pixeli la 1,7 fps folosind o intensitate constantă a laserului și un câștig PMT. Regiunile de imagistică selectate au fost alese în mod empiric ca secțiuni orizontale constând în repere observate la o adâncime de ~61-65 µm în filmul suplimentar 1.
Compararea mersului cu sau fără disecție
Pentru a evalua efectele disecției asupra locomoției, animalele de tip sălbatic au fost supuse următoarei proceduri. Animalele au fost montate pe platouri de imagistică și în fiecare platou s-a adăugat soluție salină. Doar un subset aleatoriu de animale a fost disecat. Fiecare muscă montată a fost apoi plasată pe banda de alergare sferică și comportamentele sale de mers au fost înregistrate timp de 30 de minute. Fluxul optic a fost înregistrat conform descrierii de mai sus. Pentru a crește probabilitatea de locomoție, un impuls de 500 ms de CO2 100% a fost direcționat către antenele muștelor cu un interval de un minut între impulsuri (0,05 ln min-1 folosind un controler de debit masic; Vögtlin Instruments, Elveția).
Stimulare antenară cu laser în infraroșu
Pentru a compara comportamentele de mers între animalele Act88F:Rpr și cele de control, am stimulat antenele acestora cu un laser în infraroșu apropiat de 830 nm (Schäfter + Kirchhoff, Germania). Am anesteziat mai întâi animalele femele de 7-8 dpe la 4 °C și le-am montat pe platouri de imagistică. Muștele au fost apoi aclimatizate timp de 10 min. Pentru fiecare experiment, un animal a primit zece impulsuri de stimulare cu laser de 2 s (18,1 mW) la antena sa dreaptă la un interval de 60 s între impulsuri. Animalele de control și Act88F:Rpr au fost testate în alternanță pentru a minimiza efectele timpului circadian asupra comparațiilor comportamentale.
Statistică
Dimensiunile eșantioanelor pentru experimentele pe animale au fost alese după cum urmează: am efectuat cel puțin trei experimente pentru a ilustra înregistrările neuronale populaționale și rare și am efectuat mai mult de zece experimente pe grup atunci când am efectuat comparații statistice. Un criteriu prestabilit de semnale de fluorescență cu un raport semnal-zgomot scăzut a dus la eliminarea a două experimente MDN din setul nostru de date. Nu a fost utilizată nicio randomizare sau orbire. Pentru stimularea antenară cu laser, datele nu au fost distribuite în mod normal, astfel că au fost efectuate testele Friedman și Mann-Whitney U. Estimările de variație sunt prezentate ca medie și intervale de încredere de 95% bootstrap.
Analiza datelor
Am analizat toate datele folosind scripturi Python personalizate. Deoarece frecvența de achiziție a datelor a fost diferită pentru fluxul optic, videografia comportamentală și imagistica 2-fotonică, am interpolat semnalele pentru a se potrivi cu cele de cea mai înaltă frecvență. Ulterior, datele fluxului optic au fost netezite folosind o medie curentă (fereastră = 200 ms) și apoi traduse în rotații s-1 pentru axele anterior-posterior, medial-lateral și yaw22. Pentru a face aceste măsurători mai intuitive, rotațiile s-1 au fost apoi convertite în mm s-1 (1 rot s-1 = 31,42 mm s-1) pentru mișcările anterior-posterioare (vforward) și medial-laterale (vside) și în grade s-1 (1 rot s-1 = 360° s-1) pentru mișcările de yaw (vrotație)22.
Analiza locomoției la animalele disecate (Fig. suplimentară 2) a fost realizată după cum urmează. Datele fluxului optic Vforward pentru 20 de muște disecate și 20 de muște nedizecupate au fost eșantionate la 1500 puncte s-1 și netezite folosind o medie curentă cu durata de 0,2 s. Pentru a calcula procentul de timp în care s-a mers înainte/înapoi sau în lateral, au fost definite empiric două praguri, -0,31 mm s-1 și +0,31 mm s-1, pentru a face diferența între a sta nemișcat și mersul înainte (spre dreapta) sau înapoi (spre stânga), respectiv. Valorile peste 0,31 mm s-1 au fost considerate momente de mers înainte (spre dreapta), iar valorile sub -0,31 mm s-1 au fost considerate momente de mers înapoi (spre stânga). Valorile fluxului optic între aceste praguri au fost considerate momente de staționare. Procentul de timp de mers a fost calculat ca proporție a punctelor de date în care un animal nu a fost considerat ca stând nemișcat. În mod similar, pragurile de 10,8 și -10,8 grade s-1 au fost utilizate pentru a defini momentele de întoarcere. O repriză a fost definită ca o perioadă continuă de mers sau de întoarcere.
În timpul comportamentului ar putea avea loc deformări mari ale țesuturilor. Prin urmare, am efectuat înregistrarea post-hoc a imaginilor pan-neuronale (Fig. 2). Am înregistrat toate cadrele unui experiment de imagistică la o imagine de referință. Deoarece complexitatea deformărilor nu a putut fi captată cu ajutorul unor modele de mișcare parametrice simple (de exemplu, transformări afine), am utilizat o abordare variațională, non-parametrică, concepută pentru a modela deformări arbitrar de complexe. Am calculat câmpul de mișcare w între imaginea de referință, notată Ir, și imaginea la momentul t, notată It, prin rezolvarea problemei de minimizare
unde D(w) este un termen de ajustare a datelor, al doilea termen este o regularizare care promovează netezirea lui w prin penalizarea gradientului său ∇w41, Ω este domeniul discret al imaginii, iar parametrul λ echilibrează contribuțiile celor doi termeni.
Imaginile CGaMP6s reprezintă o provocare pentru estimarea mișcării deoarece activitatea neuronală produce modificări locale mari de intensitate. Prin urmare, am folosit un fluorofor suplimentar independent de activitate, tdTomato, și am definit un termen de date de forma
Primul termen modelează ipoteza standard de conservare a intensității de-a lungul traiectoriei fiecărui pixel. Acesta este definit prin
unde folosim o normă \(\ell _1\) pentru a obține o robustețe parțială la schimbările de intensitate42. Al doilea termen din Ecuația (2) este o constrângere de potrivire a caracteristicilor inspirată de Revaud și colaboratorii43, scrisă ca
În ecuațiile (2)-(4), Ir și It sunt din canalul tdTomato. Minimizarea funcției ϕ favorizează vectorii de mișcare w(x) să fie apropiați de corespondențele caracteristice m(x, Ir, It), calculate pe un set rarefiat de puncte cheie relevante. Obținem m cu ajutorul algoritmului de potrivire a caracteristicilor propus de Revaud și colaboratorii43 , care este special conceput pentru a gestiona deformările mari ale imaginii. Calculăm m utilizând canalul de imagistică tdTomato, astfel încât corespondențele sunt, de asemenea, insensibile la schimbările de intensitate dintre Ir și It. Ca urmare, estimarea este ghidată de corespondențe fiabile ale caracteristicilor. Parametrul γ echilibrează cei doi termeni din Ecuația (2).
Pentru fiecare experiment, am optimizat valorile pentru λ și γ folosind o căutare în grilă pentru a înregistra imagini în secțiune orizontală ale VNC (Fig. Suplimentară 4). Ca funcție obiectiv pentru optimizare, am utilizat gradientul imaginii medii temporale44. Valorile mici ale lui λ (de exemplu, λ < 1000), au dus ocazional la apariția unor artefacte în imaginile înregistrate. Aceste artefacte au fost asociate cu o convergență puternică în câmpul vectorial w(x) (Fig. suplimentară 4c). Prin urmare, am definit în mod empiric artefactele ca fiind grupuri de pixeli cu \({\mathrm{div}}\,{\mathbf{w}}\left( {\mathbf{x}} \right) < – 1,2\) și cardinalitate >20 (am obținut rezultate similare cu cardinalitate >5). În cele din urmă, am selectat valorile λ și γ ca fiind cele fără artefacte și cu cel mai mare gradient al imaginii medii. Exemplele de imagini neînregistrate, câmpurile vectoriale de transformare și imaginile înregistrate ale celor trei exemple optimizate sunt prezentate în filmul suplimentar 5.
Am rezolvat problema de optimizare din ecuația (1) cu un algoritm ADMM (alternated direction method of multiplier – metoda multiplicatorului cu direcție alternată)45. Am introdus două variabile de divizare, asociate cu termenii de regularizare și, respectiv, de potrivire a caracteristicilor. Fiecare subproblemă a algoritmului a fost rezolvată analitic. Am utilizat părți ale bibliotecii de probleme inverse descrise în ref. 46. A fost aplicată o postprocesare bazată pe filtrarea mediană ponderată, folosind metoda din47.
În Fig. 2, comportamentele au fost adnotate semi-automat, folosind un modul Python personalizat. Acest modul permite utilizatorului să selecteze două regiuni de interes (ROI) pe primul cadru al videoclipului. Prima ROI este utilizată pentru a detecta mersul și trebuie să fie poziționată peste picioarele metatoracice și mezotoracice. Cel de-al doilea ROI este responsabil pentru detectarea îngrijirii picioarelor protoracice și trebuie să fie poziționat în fața muștelor. Pentru a detecta mișcarea în aceste regiuni, se sustrag cadrele consecutive. Imaginile diferențiale rezultate sunt apoi încețoșate median (rază = 5 pixeli), pentru a reduce zgomotul. Pe baza acestei imagini încețoșate, se aplică un prag privind numărul de pixeli fără zerouri în fiecare dintre cele două ROI pentru a extrage secvențe binare de toaletare și de mers. Rețineți că mișcările picioarelor protoracice observate în timpul mersului sunt ignorate (adică, clasificarea grooming-ului este subordonată clasificării mersului). Un filtru de histerezis a fost apoi aplicat pentru a filtra cu trecere joasă secvențele comportamentale binare și pentru a elimina tranzițiile care apar în prea puține cadre pentru a fi plauzibile din punct de vedere biologic. Exemple de ROI și adnotări comportamentale sunt ilustrate în filmul suplimentar 6. Aceste date comportamentale au fost utilizate în Fig. 2, așa cum se arată în Filmul suplimentar 2. A fost adnotat folosind următorii parametri: pragul pentru mers = 400, pragul pentru toaletare = 5, lungimea histerezisului pentru mers = 8, lungimea histerezisului pentru toaletare = 10.
Pentru Fig. 2b, c, am folosit regresia liniară pentru a găsi regiuni în VNC asociate fie cu mersul, fie cu toaletarea. Regresorii Xw și Xg (pentru mers și, respectiv, toaletare) au fost construiți din cele două secvențe comportamentale, Sw și Sg, folosind Ecuația (5) prin convoluție cu un răspuns la impuls al semnalului de calciu cu descreștere exponențială (CIR) derivat din constanta de timp măsurată pentru GCaMP6s (t½ = 1,1448 s)19.
Funcțiile țintă au fost urme ∆F/F în funcție de pixel, unde ∆F = Ft – F. Ft este fluorescența la momentul t. F este un semnal de fluorescență de bază măsurat ca valoare medie a pixelilor pentru primele zece imagini secvențiale GCaMP6s în care nu s-a observat activitate celulară (adică, fluorescență minimă și neschimbătoare a GCaMP6s).
Ponderile regresorilor au fost calculate folosind Ecuația (6).
unde y este urma ∆F/F la nivel de pixel.
Figura 2b, c prezintă hărți termice ale ponderilor regresorilor, ww pentru mers și wg pentru toaletare, normalizate la maximele lor respective. ROI 1 a fost ales ca o regiune a hărții termice cu o pondere ridicată pentru toaletare, dar cu o pondere scăzută pentru mers. ROI 2 a fost ales ca locație spațială cu cea mai mare valoare a ww. Fiecare ROI cuprinde o regiune cu o rază de 15 pixeli.
Pentru a identifica datele de imagistică neuronală rarefiate de procesare (figurile 3-5), ROI-urile au fost mai întâi selectate folosind scripturi Python personalizate care depindeau de bibliotecile OpenCV și Numpy. Pentru a face acest lucru, a fost selectat un cadru de referință pentru care software-ul a identificat toate ROI-urile potențiale. Pentru a face acest lucru, imaginea GCaMP6s a fost netezită pentru a reduce zgomotul de fond și apoi a fost aplicat un prag al filtrului Otsu la imagine. Un factor de eroziune a fost apoi aplicat tuturor obiectelor detectate în cadrul imaginii. Contururile tuturor obiectelor detectate au fost apoi prezentate utilizatorului pentru selectarea manuală. După ce aceste ROI de referință au fost selectate pentru neuronii din stânga și din dreapta, am utilizat un algoritm de înregistrare a imaginii bazat pe corelația încrucișată48 pentru a identifica cele mai probabile ROI din stânga și din dreapta pentru fiecare cadru de imagine, pe baza celor selectate manual pe cadrul de referință. Un al doilea script a fost utilizat pentru a verifica manual ROI-urile selectate automat și, dacă erau incorecte, pentru a afișa toate ROI-urile potențiale din cadrul cadrului pentru selectarea manuală. În cazul în care valorile de eroziune produceau ROI-uri malformate, un alt script a fost utilizat pentru a poziționa manual ROI-uri eliptice de orientare arbitrară pe orice cadru dat. În cele din urmă, imaginile ROI binare au fost utilizate ca o mască de imagine pentru a extrage semnalele medii de fluorescență din imaginile originale GCaMP6s sau tdTomato. Aceste semnale au fost raportate ca %∆R/R ca în ref. 49 pentru a reduce efectele mișcării asupra măsurătorilor noastre. Din cauza absenței stimulilor, linia de bază R a fost calculată ca fiind raportul minim al GCaMP6s/tdTomato într-un bin de 2,5 s.
Pentru a detecta creșterile tranzitorii ale activității, am dezvoltat un algoritm bazat parțial pe ref. 50. Am determinat mai întâi momentul în care prima derivată a semnalului %∆R/R a depășit un prag, care a fost determinat prin examinarea tuturor valorilor derivatei pentru o anumită clasă de neuroni (MDN, MAN sau A1). Am motivat că valorile de prag ar trebui să fie caracteristice și potențial diferite pentru fiecare tip de neuron, deoarece dinamica fluorescenței este legată de proprietăți fiziologice intrinseci care pot diferi între clasele de neuroni, dar nu între experimentele pentru o singură clasă. Am stabilit acest prag ca fiind percentila 97,5 pentru MDN-uri și dMAN-uri și percentila 90 pentru neuronii A1. O valoare de prag mai mică a fost selectată pentru neuronii A1 deoarece au fost observate mult mai multe tranziții de fluorescență în urmele A1. Aceste tranziții ar fi fost trecute cu vederea folosind un prag de 97,5 percentila. Pentru a identifica debutul creșterilor de fluorescență, am găsit cel mai apropiat punct de timp precedent în care derivata a trecut pe zero. Această trecere pe zero este considerată punctul temporal al unui „eveniment” asociat cu creșterea de fluorescență identificată. Evenimentele detectate foarte apropiate unele de altele, fără trecere prin zero a derivatei, au fost comprimate într-un singur eveniment asociat cu primul punct temporal. Au existat ~10 experimente separate pentru fiecare animal. Evenimentele din primele și ultimele 10 s ale fiecărui experiment nu au fost luate în considerare, deoarece fereastra de prezentare a datelor a cuprins 10 s înainte și 10 s după fiecare eveniment.
Pentru că activitățile MDN și dMAN din stânga și din dreapta au coabitat puternic (Fig. Suplimentară 5), a fost efectuată o etapă suplimentară pentru detectarea evenimentelor: dacă evenimentele au fost detectate atât în neuronii din stânga, cât și în cei din dreapta, la o distanță de 2 s unul față de celălalt, ambele evenimente au fost reținute; în caz contrar, un eveniment identificat pentru neuron A (de ex, MDN stâng) și nu pentru neuronul B (de exemplu, MDN drept) a fost, de asemenea, adăugat la biblioteca de evenimente a neuronului B.
În schimb, activitățile A1 stâng și drept nu au covariat puternic. Prin urmare, evenimentele au fost asociate cu unul și nu cu celălalt neuron. Pentru a realiza acest lucru, dacă un eveniment a fost detectat atât pentru neuronul A1 stâng, cât și pentru cel drept, într-o fereastră de timp de 0,25 s, niciunul dintre evenimente nu a fost utilizat pentru analiză.
%∆R/R și urmele fluxului optic legate de fiecare eveniment au fost aliniate prin setarea punctelor de timp ale evenimentului la 0 s. Apoi am calculat media și intervalele de încredere de 95% bootstrapate pentru aceste urme aliniate utilizând biblioteca Python Seaborn. Măsurătorile fluxului optic și ale %∆R/R au fost eșantionate la 500 de valori s-1 pentru această analiză. Pentru a spori claritatea, urmele %∆R/R au fost reduse la linia de bază pentru a le face zero la momentul evenimentului în panourile de rezumat (Fig. 3d, 4d și 5d, e). Datele de control, amestecate (urme gri) au fost calculate prin atribuirea în schimb a unor puncte de timp aleatorii în locul evenimentelor reale, identificate. Aceste puncte de timp aleatorii au fost tratate ca evenimente reale, iar media lor și intervalele de încredere de 95% bootstrapate au fost calculate și reprezentate grafic pentru comparație.
Analiza de covarianță (Fig. suplimentară 5) a fost efectuată cu ajutorul unui script Python personalizat care a depins de bibliotecile Matplotlib și Numpy. S-au calculat diagrame de dispersie pentru a compara valorile %∆R/R ale neuronilor stâng și drept din toate experimentele pentru fiecare muscă în parte. Valorile Pearson’s r sunt raportate ca medie ± abatere standard.
Comportamentele legate de evenimente (filmele suplimentare 8, 10, 12 și 13) au fost selectate manual din evenimentele detectate automat, așa cum este descris mai sus. Pentru dMANs, evenimentele au fost selectate dintre cele care au maximizat diferența de rotații anterioare-posterioare ale bilei între 1 s înainte și 2 s după eveniment. Pentru MDN-uri, evenimentele au fost selectate dintre cele care au minimizat rotațiile anterioare-posterioare ale bilei până la 2 s după eveniment. Pentru neuronii A1, evenimentele au fost selectate dintre cele care au maximizat rotațiile medii ale bilei de yaw (pozitive pentru exemplele de neuroni A1 din stânga și negative pentru exemplele de neuroni A1 din dreapta) timp de până la 2 s după evenimente.
În figura suplimentară 8, răspunsurile la stimularea cu laser în infraroșu apropiat au fost mediate pe 10 încercări pentru fiecare animal. Fluxul optic a fost micșorat la 500 de valori s-1. Media și intervalele de încredere bootstrapped de 95% pentru urmele fluxului optic au fost măsurate și reprezentate grafic cu ajutorul bibliotecii Python Seaborn. Biblioteca Python Scipy a fost utilizată pentru a efectua testele Friedman și Mann-Whitney U.
.