Biochemical and Pathogenic Properties ofShewanella alga and Shewanella putrefaciens

REZULTATE

Biotiparea izolatelor de Shewanella în conformitate cu două scheme distincte a dat rezultate similare (Tabelul 1). Majoritatea izolatelor clinice (74%) au aparținut biovarului Gilardi 2 (CDC biotip 2), fiind negative la zaharoză și maltoză în timp ce creșteau pe agar SS și pe medii care conțineau concentrații ridicate de NaCl. Singura diferență majoră observată între schema de clasificare Gilardi (6) și cea a lui Weyant et al. (22) a fost aceea că izolatele biovar 3 (zaharoză, maltoză, SS și NaCl negative) nu au fost grupate de sistemul de biotipare CDC. Spre deosebire de izolatele umane, biovarul 1 (biotip CDC 1) a predominat (67%) în rândul tulpinilor non-umane. Aceste tulpini au produs de obicei acid din maltoză și/sau zaharoză și nu au reușit să se dezvolte pe agar cu conținut ridicat de sare sau SS. Pe baza propunerilor taxonomice recente ale lui Nozue ș i ale altora (15), tulpinile biovar 2 (CDC biotip 2) ar fi identificate ca S. alga, în timp ce toate tulpinile biovar 1 (CDC biotip 1) ș i 6 din 7 tulpini biovar 3 ar fi denumite S. putrefaciens; tulpina biovar 3 rămasă a fost identificată ulterior ca S. alga. Din punct de vedere clinic, s-a constatat că S. alga predomină (77%), în timp ce majoritatea izolatelor neumane (89%) au fost confirmate ca fiind S. putrefaciens (tabelul 1).

Toate cele 10 izolate de Shewanella, atunci când au fost testate pe sistemele API 20E, API NFT, RapID NF Plus și Vitek, au fost identificate ca fiindS. putrefaciens, cu o singură excepție. Patru dintre cele cinci izolate deS. putrefaciens au produs numere de profil inacceptabile pe sistemul API 20E (nr. 0602026 și 0602006); a cincea tulpină a generat un număr de biotip rar pentru S. putrefaciens. Toate tulpinile de S. alga au produs o identificare excelentă ca fiind S. putrefaciens pe API 20E. Sistemul API NFT a identificat toate cele 10 izolate de Shewanella ca fiind S. putrefaciens cu identificări bune până la excelente, cu o singură excepție, tot o tulpină S. putrefaciens (valoare discriminatorie scăzută, 48 h). RapID NF Plus a identificat toate cele 10 izolate de Shewanella ca fiind S. putrefaciens, cu o precizie de 99,9%. În mod similar, toate tulpinile au fost identificate de Vitek (cu o precizie de 97 până la 99%) ca fiind S. putrefaciens, deși trei tulpini S. putrefaciens au necesitat între 5 și 9 ore de incubare înainte de identificarea finală, spre deosebire de rezultatele de 4 ore pentru celelalte 7 tulpini. Cu toate acestea, reacțiile la carbohidrați (arabinoză și maltoză) pe sistemele API 20E, API NFT și Vitek permit ca majoritatea tulpinilor să fie atribuite corect la taxonii relevanți (S. putrefaciens și S. alga) dacă sunt citite manual după identificarea finală ca S. putrefaciens.

Compararea proprietăților biochimice și enzimatice ale speciilor deShewanella a evidențiat o serie de diferențe (tabelul 2). Hemoliza pe agar de sânge de oaie, așa cum au raportat Nozue et al. (15), a fost detectată la toate tulpinile de S. alga, dar numai la câteva izolate de S. putrefaciens. Majoritatea tulpinilor de S. alga au prezentat acest fenotip numai după o incubare prelungită (48 până la 72 de ore), iar zona de hemoliză a fost adesea neregulată ș i dificil de detectat. Au fost confirmate și alte activități despre care s-a constatat anterior că ajută la separarea dintre S. alga și S. putrefaciens, cum ar fi creșterea la 42°C, creșterea pe medii care conțin concentrații mari de sare (6,5%) și producerea de acid din l-arabinoză, zaharoză și maltoză. Am descoperit un număr substanțial mai mare de tulpini de S. putrefaciens care au crescut pe agar SS decât s-a raportat anterior; majoritatea acestora provin din surse neumane. Cu excepția ribozei, producția de acid din oxidarea carbohidraților a fost asociată exclusiv cu S. putrefaciens. Cu toate acestea, modelele de zahăr au variat considerabil între aceste izolate, unele fiind pozitive la arabinoză, maltoză și zaharoză, în timp ce altele au fost pozitive doar la maltoză sau au fost asacarolitice (tulpini biovar 3). Au fost detectate mai multe activități enzimatice noi în rândul izolatelor Shewanella selectate, care, după cunoștințele noastre, nu au fost raportate anterior. Acestea au inclus activități de tirozinază, alchilsulfatază, chitinază și elastază (tabelul 2); cele mai multe dintre aceste enzime au fost găsite în izolatele neumane deS. putrefaciens. Majoritatea tulpinilor de S. alga șiS. putrefaciens au produs un siderofor, după cum s-a determinat prin testele Chrome Azurol S. Această activitate a fost slabă, iar cinci izolate (trei izolate de S. alga și două izolate de S. putrefaciens) nu au reușit să se dezvolte pe acest mediu.

Select Shewanella izolate care au crescut bine la 35°C au fost în continuare caracterizate pentru activitatea enzimatică cu ajutorul API-ZYM (tabelul 3) și pentru profilurile de acizi grași celulari cu ajutorul sistemului MIDI. Dintre cele nouă substraturi atacate de una sau ambele specii de Shewanella cu API-ZYM, activitățile globale mai mari pentru șapte dintre aceste enzime au fost asociate cu S. alga. Singura activitate care s-a dovedit a fi mai puternică la S. putrefaciens a fost valina arilamidaza, deși această activitate a fost extrem de slabă chiar și la aceste tulpini. Ambele specii au produs o activitate de fosfatază alcalină uniform de puternică. O observație suplimentară a fost aceea că toate tulpinile de S. alga au produs în mod constant opt din aceste nouă enzime, singura excepție fiind valina arilamidaza. În schimb, S. putrefaciens a fost mai eterogenă, patru dintre cele nouă enzime detectate nefiind prezente în mod universal în toate izolatele. Analiza a 14 tulpini de Shewanella a indicat că acizii grași predominanți au fost i-15:0, 17:1ω8c și 16:0; unele tulpini au produs cantități mari de 16:1ω7c (9 până la 18%), în timp ce altele au produs cantități neglijabile. Deși majoritatea vârfurilor de acizi grași au fost destul de consistente între tulpinile de S. alga și S. putrefaciens testate, s-au observat câteva diferențe (tabelul4). Valorile medii mai mari ale acidului pentadecanoic și ale acidului cis-9-heptadecenoic (17:1ω8c) au fost observate pentru S. alga, în timp ce invers a fost valabil pentru S. putrefaciens în ceea ce privește acizii hexadecanoic și dodecanoic. Pentru acidul hexadecanoic, nu s-a observat nicio suprapunere în intervalul total de acizi grași între S. alga și S. putrefaciens; pentru acidul pentadecanoic și 17:1ω8c, doar un singur izolat S. putrefaciens sau S. alga a produs o valoare care se încadrează în intervalul celuilalt. În timp ce nici un singur vârf nu a fost diagnosticat, utilizarea tuturor celor patru vârfuri împreună a separat în mod clar tulpinile 14Shewanella în două grupuri de-a lungul liniilor de specii.

S-a constatat că cele 23 de tulpini de S. putrefaciensau putut fi împărțite în trei grupe distincte pe baza mai multor caracteristici fenotipice (tabelul 5). Grupul 1, format din opt tulpini, inclusiv ATCC 8073, a produs acid din maltoză, zaharoză și arabinoză și a utilizat acid urocanic. Tulpinile din grupa 1 au fost împărțite în mod egal între izolatele clinice și cele non-umane. Tulpinile din grupa 2 (n = 6), printre care se numără ATCC 8071, se disting de cele din grupa 1 în principal prin incapacitatea de a oxida zaharoza ș i maltoza. Din nou, jumătate din aceste tulpini proveneau din material clinic. Tulpinile din grupa 3 (n = 9), toate de origine ambientală (zona lacului Michigan), se deosebeau în mod dramatic de cele din grupele 1 ș i 2. Acestea au crescut slab sau nu au reușit să crească la 35°C, au produs chitinază și nu au fost pigmentate pe agar-triptofan. Toate cele nouă tulpini din grupa 3 au produs inițial α-glucozidază, dar la retestare numai trei tulpini au fost în mod constant pozitive. Maltoza a fost oxidată, dar nu și zaharoza sau arabinoza. Spre deosebire de grupele 1 și 2, acidul urocanic nu a fost utilizat ca sursă de energie.

Recent, Vogel și colaboratorii (21) au observat diferențe între S. alga și S. putrefaciens în ceea ce privește sensibilitatea lor la anumiți agenți antimicrobieni, inclusiv penicilină, ampicilină și tetraciclină. Acest lucru, împreună cu raportul care leagă activitatea hemolitică de S. alga și asocierea sa aparentă cu bolile umane, sugerează posibile diferențe de patogenitate între aceste două specii (tabelul 6). Prin urmare, am selectat 10 tulpini (5 din fiecare specie) pentru analize suplimentare. Deși nu am observat diferențe majore în ceea ce privește sensibilitatea la penicilină, ampicilină și tetraciclină între aceste două grupuri în funcție de categoria de sensibilitate (sensibilă, intermediară sau rezistentă), am observat că valorile medii ale CMI pentru S. alga la penicilină, ampicilină și tetraciclină (∼200, 56 și 5.2 μg/ml, respectiv) au fost mai mari decât MIC-urile corespunzătoare pentru S. putrefaciens (3, 1,3 și, respectiv, 1,1 μg/ml).

Patru din cele cinci tulpini de S. putrefaciens s-au atașat slab (+) până la puternic (+++) (tabelul 6) de celulele HEp-2 în testele de aderență; în schimb, nicio tulpină de S. alga nu a prezentat caracteristici adezive similare, deși patru tulpini s-au legat puternic de fundalul lamei de sticlă. Activitățile invazive nu au fost detectate la nicio tulpină de Shewanella. Deși s-a observat o reacție hemolitică întârziată pe agarul cu sânge de oaie pentru toate cele cinci tulpini de S. alga (tabelul 2), nu s-a detectat o beta-hemoliză prin tehnica de suprapunere a agarului sau prin testele în bulion (tabelul 6); tulpinile de E. tarda de control au fost pozitive în 1 oră la ambele teste. Pentru toate cele cinci tulpini de S. alga (și un izolat de S. putrefaciens), s-a observat uneori o reacție citotoxică slabă în timpul studiilor de aderență și invazie. Această reacție citotoxică s-a manifestat prin apariția de celule HEp-2 cu morfologie celulară anormală, inclusiv resturi celulare (fantome). Cu toate acestea, s-au constatat diferențe în ceea ce privește patogenitatea la șoareci între aceste două specii, deoarece LD50 medie la șoarecii Swiss Webster pentru S. algawas 1,9 × 108 UFC, în timp ce cea pentru S. putrefaciens a fost de 8,4 × 108 UFC (P < 0,02).

.