Liniile celulare
Liniile celulare și sursele lor sunt după cum urmează: 293T (ATCC CRL-11268), 786-O (ATCC CRL-1932) și HK-2 (ATCC CRL-2190). Celulele THP-1 au fost furnizate cu amabilitate de Banca de celule stem, Academia Chineză de Științe. Celulele au fost cultivate în mediu DMEM (pentru 293T și 786-O), MEM (pentru HK-2) sau RPMI 1640 (THP-1) cu 10% ser fetal de bovine și 2 mM l-glutamină, la 37 °C în prezența a 5% CO2. Înainte de infectarea cu bacterii, tratarea cu proteine sau analiza chemotaxei, mediul a fost schimbat în mediu fără ser.
Sușe bacteriene și plasmide
Sușetele bacteriene și plasmidele utilizate în acest studiu sunt enumerate în tabelul suplimentar S3. Tulpinile de E. coli au fost cultivate la 37 °C în mediu Luria-Bertani (LB), în condiții statice, timp de 12 h, cu antibiotice adecvate atunci când a fost necesar, la următoarele concentrații: Kanamicină la 50 μg/ml, ampicilină la 100 μg/ml și cloramfenicol la 15 μg/ml. Tulpina ΔhlyA a fost generată prin înlocuirea genei hlyA cu o genă cat cu ajutorul recombinazei λ-Red. Pentru a genera tulpina ∆hlyA p-hlyA, gena hlyA a fost amplificată prin PCR din cromozomul tulpinii UPEC CFT073 și ligaturată în pTRC99A la situsurile enzimatice KpnI și XbaI, iar plasmidul a fost transformat în ∆hlyA prin electroporare. Genele hlyC și hlyA din CFT073 sau ADN-ul complementar (ADNc) care codifică pentru Nectin-2 a fost amplificat prin PCR și clonat în pET-28a ( + ) pentru a produce proteine recombinante active HlyA sau Nectin-2 cu marcaj FLAG sau HA. Pentru a produce HlyA inactiv marcat cu FLAG (pro-HlyA), gena hlyA fără hlyC din CFT073 a fost clonată în pET-28a ( + ) la situsurile enzimatice XbaI și XhoI. Nectina-2 marcată cu Myc a fost integrată în vectorul pLenti-Hygro pentru transfecție.
Exprimarea și purificarea proteinelor recombinante HlyA, pro-HlyA și Nectina-2 umană
Exprimarea HlyA sau pro-HlyA recombinante a fost realizată în E. coli BL21 (DE3), iar exprimarea Nectinei-2 a fost realizată în Rosetta (DE3). Înainte de inducția cu 100 μM IPTG, bacteriile au fost cultivate la 37 °C până când au atins o DO600 de 0,6 până la 0,8. Bacteriile cultivate au fost colectate prin centrifugare (8000 × g timp de 5 minute la 4 °C) după 12 ore de inducție la 16 °C în LB cu IPTG. Bacteriile au fost lizate cu lizozim și ultrasunete, iar supernatantul a fost centrifugat pentru a elimina particulele (18 000 × g timp de 30 de minute la 4 °C). Proteinele au fost apoi purificate cu ajutorul sistemului de purificare Ni-NTA (GenScript, Nanjing, China). Proteinele au fost eluate cu 250 mM imidazol. Fracțiunile cu fragmente HlyA au fost grupate, dializate în 150 mM imidazol, 50 mM imidazol și de două ori cu PBS. Ulterior, fracțiunile care conțineau proteina dorită au fost concentrate la 500 μl cu ajutorul unităților de filtrare centrifugă Amicon Ultra-15 (Millipore, Burlington, MA, SUA). Ultimul tampon de dializă care a avut un mediu ionic similar cu cel al proteinei HlyA purificate a fost utilizat ca martor pentru proteina purificată în experimente. Concentrația finală a proteinei a fost determinată spectrofotometric (Nanodrop-2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) folosind kitul BCA Protein Assay Kit (23225, Thermo Scientific).
Model de pielonefrită de șoarece
Toate studiile pe animale au fost revizuite și aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Universitatea de Medicină din Tianjin, Tianjin, China. Am depus toate eforturile pentru a minimiza suferința animalelor și pentru a reduce numărul de animale utilizate. Șoarecii femele C57BL/6J, în vârstă de 6-8 săptămâni, au fost achiziționați de la Academia de Științe Medicale Militare (Beijing, China). Modelul de pielonefrită acută la șoareci a fost stabilit așa cum a fost descris anterior.53 Bacteriile au fost cultivate peste noapte în mediu LB static la 37 °C. Bacteriile cultivate au fost peletizate prin centrifugare (5000 × g timp de 5 minute la 4 °C) și resuspendate în PBS pentru a obține o densitate de 2 × 1010 UFC/ml. La un interval de 3 h, șoareci femele C57BL/6J anesteziați au fost inoculați intrauretral cu 50 μl de tulpini UPEC (109 CFU) de două ori.54,55 La 12, 24 și 48 hpi, șoarecii au fost sacrificați, iar rinichii lor au fost îndepărtați aseptic și omogenizați în 1 ml de PBS conținând 0,025 % Triton X-100, apoi au fost diluați în serie pentru numărarea bacteriilor. La 24 hpi, țesuturile renale au fost, de asemenea, utilizate pentru citometrie în flux, histologie și analiza citokinelor proinflamatorii.
Analiză prin citometrie în flux
Suspensiile unicelulare au fost generate prin digestie cu 1,5 mg/ml de colagenază IV (C5138, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA) și 100 ng/ml de DNază I în PBS timp de 30 min la 37 °C sub agitare ușoară. Suspensiile de celule digerate au fost apoi filtrate printr-un filtru celular de 70 μm (352350, BD Biosciences, San Jose, CA, SUA) pentru a obține suspensii unicelulare. Receptorii Fc au fost blocați cu CD16/32 (101319, Biolegend, San Diego, CA, SUA), iar suspensiile unicelulare au fost apoi incubate cu următorii anticorpi: anti-CD11b conjugat cu APC (17-0112-82, Thermo Fisher Scientific), anti-Ly6G conjugat cu PE (127608, Biolegend), anti-F4/80 conjugat cu FITC (11-4801-82, Thermo Fisher Scientific), anti-CD11c conjugat cu PE (127608, Biolegend), anti-CD206 conjugat cu PerCP/Cy5.5 (141716, Biolegend). Celulele au fost analizate pe un citometru în flux FACSCanto II (BD Biosciences) utilizând software-ul Flow Jo (FlowJo, Ashland, OR, SUA).
&E colorare și imunohistochimie
Regnii au fost fixați în formalină tamponată cu fosfat 10% timp de cel puțin 24 h. Țesutul fixat a fost apoi încorporat în parafină și tăiat în secțiuni de 5μm. Lamele au fost colorate cu hematoxilină și eozină. Modificările histopatologice renale au fost evaluate folosind o scală de 6 puncte în care 0, 1, 2 și 3 au indicat leziuni histologice normale, ușoare, moderate și severe (leziunile patologice au fost localizate în principal în medulla și joncțiunea cortico-medulară); între timp, 4, 5 și 6 au indicat leziuni histologice ușoare, moderate și severe (leziunile patologice au fost localizate în principal în mai multe părți ale rinichiului). Examinările histologice au fost analizate de două persoane care au fost orbite la grupurile experimentale.56,57 Pentru analiza imunohistochimică, secțiunile au fost colorate cu anticorpul anti-Nectin-2 (27171-I-AP, 1:200, Proteintech, Chicago, IL, SUA). Imaginile au fost achiziționate la microscop (BX46, Olympus, Tokyo, Japonia).
Analiză de imunofluorescență a țesuturilor și celulelor
Rebnii au fost încorporați în compus OCT cu azot lichid. Blocurile congelate au fost tăiate în secțiuni de 5 µm și uscate la aer la temperatura camerei timp de 1 h și fixate cu acetonă rece timp de 10 min. Secțiunile congelate au fost apoi imediat scufundate în metanol timp de 20 min și apoi în metanol cu 3% peroxid de hidrogen timp de 10 min. Țesuturile au fost blocate cu 5% albumină serică bovină (BSA) timp de 1 h, incubate cu anticorp anti-F4/80 (ab6640, Abcam, 1:200), anticorp anti-Ly6G (ab210402, Abcam, 1:200), anticorp Nectin-2, (ab135246, Abcam, 1:200) în tampon de blocare peste noapte la 4 °C, dacă este necesar. Apoi, lamelele au fost spălate de cinci ori cu PBS și au fost incubate cu un anticorp secundar marcat cu Alexa Fluor 488/549 (Proteintech, 1:200) timp de 1 h la temperatura camerei. Pentru vizualizarea nucleilor, secțiunile de țesut au fost contracolorate cu DAPI. Imaginile au fost achiziționate la un microscop fluorescent (IX73, Olympus). Celulele 293T transfectate cu pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 au fost cultivate pe un coverglass cu cameră Lab-Tek și tratate cu 75 nM HlyA timp de 6 h, fixate cu paraformaldehidă 4% timp de 15 min și supuse la o colorare prin imunofluorescență cu anticorp anti-MYC-Tag (66003-2-Ig, 1:25, Proteintech) și anticorp HA-Tag (2367S, 1:200, CST) la 4 °C peste noapte. Al doilea anticorp marcat cu Alexa Fluor 488/594 (Proteintech) a fost utilizat prin incubare la temperatura camerei timp de 1 h. Celulele au fost imaginate cu ajutorul unui microscop confocal cu fluorescență (FV1000-D, Olympus).
Infectarea celulelor epiteliale renale cu tulpini UPEC
Celulele epiteliale renale umane (786-O sau HK-2) au fost însămânțate în plăci cu 24 de godeuri, cu 24 de ore înainte de infecțiile UPEC. Pentru inhibarea ADAM10, celulele au fost pre-incubate cu inhibitorul ADAM10 GI254023X (Sigma-Aldrich) timp de 20 h înainte de infecții. Celulele au fost infectate cu bacterii la multiplicitatea de infecție (MOI) indicată timp de 6 h sau stimulate cu concentrațiile indicate de HlyA purificat sau pro-HlyA timp de 12 h. În unele experimente, celulele au fost tratate cu ∆hlyA (MOI 0.01) îmbogățit cu HlyA purificat (75 nM) timp de 6 h. Pentru testul de invazie, după 6 h de infecție, celulele au fost spălate de cinci ori cu PBS și tratate cu 200 μg/ml de gentamicină timp de 1 h pentru a distruge bacteriile extracelulare. Apoi, celulele au fost spălate de două ori cu PBS și lizate cu 500 μl de 0,2% triton X-100 în PBS și au fost plasate pe plăci de agar LB pentru a număra bacteriile intracelulare.
Sondaj imunoenzimatic (ELISA)
Nivelurile de GM-CSF în supranatantul din celulele 786-O infectate, din celulele 786-O tratate cu HlyA/pro-HlyA sau din rinichii omogenizați după infecție au fost măsurate cu ajutorul unui kit de dezvoltare ELISA (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, China) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Rinichii de șoareci au fost îndepărtați și omogenizați în PBS conținând 1% Triton X-100 și tablete complete de cocktail de inhibitori de protează mini-EDTA-free (11697498001, Roche, Indianapolis, IN). Omogenatele au fost apoi incubate la gheață timp de 30 de minute și centrifugate la 10 000 × g timp de 10 minute la 4 °C; supernatantele au fost colectate și utilizate pentru testul ELISA pentru GM-CSF, IL-1β, TNF-α, IL-6 și MIP-2 în conformitate cu instrucțiunile producătorului (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, China).
Sesizări de citotoxicitate
S-au colectat supernatantele de cultură celulară de la celulele 786-O tratate cu proteine purificate sau cu tampon de dializă timp de 12 h și au fost detectate pentru lactat dehidrogenază (LDH) utilizând un kit de testare a citotoxicității non-radioactive CytoTox-96 (G1780, Promega, Madison, WI, SUA).
Eșantioane de urină de la pacienți
Eșantioanele de urină au fost colectate de la pacienții infectați cu tulpini UPEC care au urmat un tratament la cel de-al doilea spital al Universității de Medicină din Tianjin, iar prezența genei hlyA în tulpina UPEC izolată din urina fiecărui pacient în parte a fost determinată prin PCR (tabelele suplimentare S2 și S4). Urina a fost concentrată la 200 μl cu ajutorul unităților de filtrare centrifugale Amicon Ultra-15 (UFC901024, Millipore), iar apoi lichidul concentrat a fost detectat cu ajutorul kitului de dezvoltare ELISA (Neobioscience Technology Company). Studiile asociate cu eșantioane de pacienți au fost aprobate de Comitetul de etică al Universității de Medicină din Tianjin, iar consimțământul în cunoștință de cauză scris a fost obținut de la toți pacienții.
Extragerea ARN și qRT-PCR
Celele 786-O au fost infectate cu CFT073, ∆hlyA sau ∆hlyA p-hlyA (MOI 0,01) timp de 4 h. ARN-ul a fost extras cu ajutorul unui kit de extracție a ARN-ului total (Solarbio, Beijing, China) în conformitate cu protocolul producătorului și a fost transcris în sens invers cu ajutorul kitului RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific). qRT-PCR a fost realizată cu ajutorul unui amestec FastStart Universal SYBR Green Master (Roche, Basel, Elveția) pe un sistem Fast Real-Time PCR 7900 (Roche). Condițiile de cicluri PCR au fost 95 °C timp de 5 minute, urmate de 40 de cicluri de 95 °C timp de 20 s, 60 °C timp de 20 s și 72 °C timp de 20 s. β-actina a fost utilizată ca martor endogen, iar datele au fost normalizate pe baza nivelului de transcriere a β-actinei în tipul sălbatic și cuantificate prin metoda comparativă a pragului critic al ciclului 2-∆∆Ct. Primerii utilizați sunt enumerați în tabelul suplimentar S4.
Sesizări de chimiotaxie
Sesizările de migrație celulară au fost efectuate folosind camere Transwell (dimensiunea porilor 5 μm, Costar, Corning 3421, Corning, NY, SUA). Celulele THP-1 (2 × 106 în 200 μl) au fost resuspendate în mediu RPMI 1640 fără ser și adăugate în camera superioară. Supernatantul din celulele 786-O infectate a fost amestecat cu 1 μg/ml de anticorp neutralizant împotriva GM-CSF uman (502203, BVD2-23B6, Biolegend) sau cu IgG2a de control (400515, Rat IgG2a, Biolegend) și incubat timp de 30 de minute. Apoi, în camera inferioară s-au adăugat 600 μl de mediu conținând supernatantul ca agent chemoattractant. După 3 h sau 6 h de incubare la 37 °C într-o atmosferă umidificată cu 5% CO2, au fost numărate celulele migrate în camera inferioară.
Lipozomi de clodronat și tratament cu anticorpi anti-GM-CSF
Pentru a elimina macrofagele, 200 µl de PBS sau lipozomi de clodronat au fost administrați șoarecilor pe cale intravenoasă cu 24 h înainte de infecție.32,33 Pentru a neutraliza GM-CSF, anticorpul neutralizant împotriva GM-CSF (505408, MP1-22E9, Biolegend, 250 µg) sau IgG2a de control (400533, Rat IgG2a, Biolegend, 250 µg) a fost injectat intravenos la șoareci cu 1 h înainte de infecție.33,58
Corpii și Western blotting
Corpii au fost obținuți de la următoarele companii: anticorp monoclonal anti-FLAG (F1804, Sigma-Aldrich), anticorp anti-MYC-Tag (66004-I-Ig, Proteintech, Chicago, IL, SUA) și anticorp anti-Nectin-2 (ab135246, Abcam, Cambridge, Regatul Unit). Lizații de celule întregi au fost preparați folosind tamponul de liză RIPA (Millipore), cu inhibitori complecși de protează (Roche, Basel, Elveția). Kitul BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher) a fost utilizat pentru a determina concentrația de proteine. IgG anti-rabbit (1:10000, Sigma-Aldrich) sau IgG anti-șoarece (1:10000, Sigma-Aldrich) conjugate cu HRP au fost utilizate pentru a evidenția legarea anticorpilor. Complecșii imunoreactivi au fost detectați folosind Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) și au fost expuși la un aparat GE Amersham Imager 600.
Analiză de blotting far-western și LC-MS/MS
Protocolul de blotting far-western a fost realizat așa cum a fost descris anterior.59 Celulele 786-O au fost spălate de două ori cu PBS rece ca gheața, iar proteinele membranei celulare au fost izolate cu ajutorul unui kit de extracție a proteinelor din membrană și citosol (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) în conformitate cu protocolul producătorului. Proteinele solubile asociate membranei au fost analizate prin electroforeză pe gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă pe geluri de 10%. Proteinele au fost apoi transferate pe o membrană de fluorură de poliviniliden (PVDF) (Merck Millipore, Darmstadt, Germania). Proteinele transferate au fost renaturate cu ajutorul tamponului AC prin reducerea treptată a concentrației de guanidină-HCl.59 Apoi, membrana a fost blocată cu 5% lapte degresat în tampon TBST timp de 1 h. Ulterior, membrana a fost incubată cu 30 μg/ml de HlyA purificată cu marcaj FLAG sau cu tampon de dializă peste noapte la 4 °C. După spălare, membrana a fost incubată cu un anticorp anti-FLAG diluat la 1:1000 (Sigma-Aldrich) peste noapte la 4 °C în lapte degresat 5% în tampon TBST. Apoi, membrana a fost spălată bine și incubată cu IgG anti-șoarece conjugat cu HRP (1:10000, Sigma-Aldrich)
Benzile diferențiale dintre grupul tampon de dializă și grupul HlyA marcat cu FLAG au fost identificate cu ajutorul LC-MS/MS, realizat cu ajutorul unui spectrometru de masă nanoLC-LTQ-Orbitrap XL (Thermo, San Jose, San Jose, CA, SUA) cuplat cu un sistem HPLC Eksigent nano LC 1D plus în Majorbio (Shanghai, China). Peptidele triptice au fost complet digerate enzimatic și ionizate folosind ionizarea prin nanoelectrospray.33 Datele au fost analizate folosind un spectru de masă cu scanare completă (300 până la 1800 m/z). În cele din urmă, Proteome Discoverer (versiunea 1.4.0.288, Thermo Scientific) a fost utilizat pentru a analiza datele MS.
Interferența ARN și supraexprimarea Nectin-2
ARN-uri cu interferență mică (siRNA) pentru genele vizate și un siRNA de control încurcat (siScr) au fost sintetizate de GenePharma (Shanghai, China). ARNsi au fost transfectate în celule 786-O sau HK-2 cu ajutorul Lipofectaminei 3000 (Invitrogen). pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 a fost transfectată în celule 786-O sau HK-2 cu ajutorul Lipofectaminei 3000 (Invitrogen) pentru a supraexprima Nectin-2. Patruzeci și opt de ore după transfecție, celulele au fost analizate pentru expresia proteinelor prin Western blotting. Secvențele siARN-urilor sunt enumerate în tabelul suplimentar S4.
Imunoprecipitare
Celele 293T au fost transfectate cu vectorul pLenti-Hygro sau pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 și apoi cultivate timp de 48 h. Celulele au fost apoi incubate cu HlyA marcată cu FLAG (75 nM) timp de 6 h după transfecție și au fost proaspăt lizate în tampon de liză (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 % NP-40, 0,2 mM EDTA, 150 mM NaCl) pentru testele de Western blotting sau imunoprecipitare (IP). Celulele 786-O au fost incubate cu HlyA marcată cu FLAG (75 nM) sau cu tampon de dializă timp de 6 h și apoi au fost lizate cu ajutorul tamponului de liză pentru testul IP al proteinei. Supranatantele celulare au fost incubate cu margele M2 anti-FLAG (A2220, Sigma-Aldrich) sau cu margele M2 anti-Myc (A7470, Sigma-Aldrich) timp de 12 ore la 4 °C pentru IP de proteine marcate cu FLAG sau Myc. Pentru IP-ul proteinei Nectin-2, supranaturile celulare au fost incubate cu anticorpul anti-Nectin-2 (ab135246, Abcam) timp de 12 ore la 4 °C și apoi incubate cu agaroză Protein A/G (20241, Thermo Fisher) timp de 2 ore la 4 °C. IgG normală de iepure (2729S, CST) a fost utilizată ca martor. După incubare, precipitatele au fost colectate prin centrifugare, spălate de cinci ori cu tampon de liză și analizate prin imunoblotting folosind anticorpul monoclonal anti-FLAG, anticorpul anti-MYC-Tag sau anticorpul anti-Nectin-2.
HlyA recombinant recombinant FLAG-tagged exprimat bacterian, purificat (1 µg) a fost incubat cu 1 μg de Nectin-2 recombinant recombinant purificat exprimat bacterian în tampon de legare (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,1 % Triton-X 100, 100 mM NaCl, 20% glicerină, 1% BSA) timp de 12 h. Complecșii au fost apoi supuși la IP cu proteină FLAG-tagged sau IP cu proteină Nectin-2. În cele din urmă, proteinele complexate au fost analizate prin imunoblotting.
Analiză statistică
Semnificația statistică a diferențelor dintre grupuri a fost testată cu ajutorul analizei de varianță (ANOVA). Testul neparametric Mann-Whitney a fost utilizat pentru a calcula semnificația statistică în experimentele in vivo.
.