Indicações de ampla gama 16S rDNA PCR
Broad-range 16S rDNA PCR pode detectar bactérias viáveis e não viáveis, semelhante a qPCR. Também é clinicamente útil quando outras técnicas dão resultados negativos, por exemplo, em cultura – endocardite negativa, artrite séptica, meningite ou infecções de linha longa.8 11 As bactérias identificadas são frequentemente incomuns, raras, difíceis de cultivar ou bactérias para as quais uma PCR específica não está disponível.8 9 Exemplos incluem a identificação de Helicobacter sp como a causa subjacente da osteomielite ou Neisseria meningitidis como a causa inesperada da artrite séptica por PCR rDNA 16S de ampla gama, após a produção de resultados negativos a partir de outras técnicas de diagnóstico microbiano.12 13
Também é possível fazer distinções entre as espécies: Ureaplasma spp consiste em duas cepas bacterianas, Ureaplasma parvum e Ureaplasma urealyticum, indistinguíveis por cultura, e cada uma suspeita de causar patologia diferente em recém-nascidos.7 14 15 A PCR 16S rDNA de ampla gama, seguida de sequenciamento, permitiu a diferenciação e identificação de ambas as espécies, auxiliando na pesquisa de patogenicidade específica da espécie.8 16
Adicionalmente, a PCR 16S rDNA de ampla gama pode identificar bactérias anteriormente não caracterizadas. A ampla gama 16S rDNA PCR permitiu a identificação de Bartonella henselae e Tropheryma whippelii como os patógenos subjacentes à doença de Whipple e catscratch, respectivamente.17 18
No entanto, a amplitude da ampla gama 16S rDNA PCR torna-a vulnerável à contaminação. Todo o ADN bacteriano presente numa amostra é amplificado, incluindo o que está inevitavelmente presente nos reagentes, o que significa que é impossível eliminar totalmente a contaminação ambiental de baixo nível. Num elevado número de ciclos térmicos, este ADN contaminante de fundo de baixo nível será amplificado e dará um resultado falso-positivo. Para reduzir este risco, o sequenciamento deve ser realizado para distinguir entre um patógeno genuíno e contaminantes (muitas vezes bactérias transmitidas pela água, altamente improvável de causar doenças). Usando técnicas de sequenciamento padrão, apenas a sequência de ADN mais dominante pode ser identificada, o que significa que em amostras onde mais de uma espécie bacteriana está presente (como as fezes) os resultados são ininterpretáveis. Isto significa que a PCR de rDNA 16S de gama ampla com sequenciação padrão não é útil para amostras de locais não estéreis.
Para reduzir ainda mais o risco de ser dominado pela contaminação, o número de ciclos térmicos é reduzido em comparação com qPCRs específicos, mas isto tem o efeito concomitante de reduzir a sensibilidade.19 Isto significa que a PCR de rDNA 16S de gama ampla será sempre menos sensível do que uma PCR de qPCR específica bem desenhada, na ordem de 1-2 logs. Uma desvantagem final é que estes métodos podem ser limitados à pesquisa ou laboratórios especializados, o que significa que as amostras podem precisar ser enviadas para longe, aumentando o tempo de retorno.16 Uma comparação dos principais benefícios e desvantagens entre os métodos de cultura, qPCR e PCR de rDNA 16S de ampla gama é mostrada na tabela 1, e um fluxograma de investigações sugeridas para suspeitas de infecções bacterianas de locais estéreis incorporando tanto qPCR como PCR de rDNA 16S de ampla gama é mostrado na figura 1C.
Em resumo, a PCR de rDNA 16S de ampla gama é um adjunto crucial para o diagnóstico microbiológico como uma segunda linha quando se suspeita de infecção de um local estéril, mas a cultura e o qPCR para os patógenos mais prováveis têm sido comprovadamente negativos. Devido ao risco de detecção de contaminação por ADN bacteriano, são realizados menos ciclos de PCR do que para o qPCR, resultando num ensaio menos sensível, pelo que o qPCR deve ser utilizado em primeiro lugar (figura 1C). Na pesquisa, 16S rDNA PCR continuará a ser utilizado para identificar novas espécies bacterianas, caracterizar a patogenicidade específica da espécie e como um ensaio de padrão dourado para comparar quando da avaliação de novos ensaios. É também utilizado em combinação com técnicas de ponta, como o sequenciamento de próxima geração. Isto é usado para caracterizar populações microbianas complexas no intestino, fezes, vagina, placenta, pulmão e em ambientes ambientais.20 Como o sequenciamento de próxima geração baseado na PCR de rDNA 16S de ampla gama se torna mais acessível e amplamente disponível, estas técnicas têm o potencial de permitir uma terapia sob medida à medida que aumenta nossa compreensão da complexa interação entre nós e nossas comunidades microbianas.21 Por exemplo, a PCR 16S rDNA de ampla gama de comunidades intestinais microbianas identificou mudanças distintas em condições como HIV, parto pós-termo de neonatos e desnutrição.22-24 Ao explorarmos as vias terapêuticas potenciais reveladas nessas diversas condições, é provável que a PCR 16S rDNA de ampla gama seja a pedra angular de outras pesquisas.