Tetramisol (Sigma T1512, roztwór podstawowy 10 mg/mL w H2O rozcieńczony do około 100 μg/mL w solach jaj) dodanie jest opcjonalne; lek ten paraliżuje robaki i ułatwia cięcie. Cięcie należy wykonać natychmiast: jeśli będzie zbyt krótkie, robaki nie uwolnią wielu jaj. Każdego dnia używaj nowego ostrza skalpela, ponieważ szybko koroduje. Nadmiar tetramisolu spowoduje wytrącenie się osadu w roztworze NaOCl.
W celu uzyskania maksymalnej wydajności, więcej jaj można uwolnić traktując przecięte robaki przez około 1 minutę równą objętością roztworu NaOCl dodanego bezpośrednio do kropli tnącej. Jak tylko jaja zostaną uwolnione, dodaj taką samą objętość EGM jak NaOCl, aby zapobiec dalszemu uszkodzeniu jaj. Takie traktowanie zabije stadia pronuklearne i uszkodzi jednokomórkowe zarodki. 3-minutowe traktowanie NaOCl jest nadal konieczne przed poddaniem działaniu chitynazy w celu uzyskania jednolitego trawienia. W przypadku jaj wcześniejszych niż dwukomórkowe, w których skorupka jest jeszcze w pewnym stopniu przepuszczalna, należy dodać równą objętość EGM zaraz po przecięciu robaków. Po tym, wiele z nich może przetrwać 3-minutowe traktowanie NaOCl i chitynazą, a niektóre będą nadal w stadium jednokomórkowym po traktowaniu chitynazą i usunięciu otoczki szklistej, jeśli pracujesz szybko.
Zadowalające pipety transferowe są wykonane z kapilar SMI micropipettor 5- do 30-μL (Fisher 21-380-9C) lub 4-calowych kapilar World Precision Instruments (1B100F-4), przez podwójne pociągnięcie nad bardzo małym płomieniem. Wykonuje się to przez pierwsze ogrzanie i delikatne pociągnięcie, aby uzyskać cienką część środkową, następnie krótkie schłodzenie, a następnie ponowne ogrzanie, utrzymując kapilarę w napięciu do ostatniego pociągnięcia. Idealne pociągnięcie daje pipetę z wyraźnym trzonem i wąską, stopniowo zwężającą się sekcją o długości około 3/4-1 cala. Mały palnik gazowy może być wykonany przez zamontowanie dużej igły strzykawki w korku, z zaciskiem śrubowym na rurce do regulacji przepływu gazu. Alternatywnie, pipety o stałej wielkości mogą być wykonane przez przeciąganie na automatycznym pullerze. Przed użyciem należy złamać kapilarę do pożądanej końcówki, około 100-150 μm (trzy lub cztery razy więcej niż średnica jajka), zaciskając ją między paznokciem kciuka a opuszkiem palca lub używając żyletki pod mikroskopem. Mikroskop Microforge może pomóc w wykonywaniu pipet, choć nie jest to konieczne. Utrzymuj małą średnicę pipety, aby zminimalizować przenoszenie cieczy. Jeśli jaja przylgną do wnętrza pipety, wiele z nich można odzyskać, przepłukując pipetę roztworem NaOCl lub EGM. Spodziewać się należy częstej zmiany pipet, a przed sesją roboczą należy zaopatrzyć się w odpowiednią ilość pipet.
Jeśli trawienie chitynazą nie zadziała w ciągu 8 min, prawdopodobnie nie zadziała w ogóle. Najczęstsze problemy to podchloryn lub stan fizjologiczny robaków (pierwszy dzień znoszenia wydaje się dawać twardsze jaja). Podchloryn powinien pochodzić z niewygasłej partii, a zwykle staje się słaby na miesiąc przed upływem daty ważności. Przechowuj zapas w lodówce w ciemnej, wentylowanej butelce, wypełnionej prawie do samej góry. Wymieszać 3-ml probówkę tuż przed rozpoczęciem i trzymać ją na lodzie; będzie działać przez około 3 godziny, a następnie należy ją wymienić.
Po obróbce enzymatycznej, a zwłaszcza po permeabilizacji, zarodki są dość lepkie i będą się zbijać w grudki; można to zminimalizować przez pipetowanie jednego lub tylko kilku na raz. Małe grudki mogą być rozbite przez wyrzucenie z pipety z niewielką siłą kilka razy.
Permeabilizacyjne pipety są ciągnięte ręcznie w taki sam sposób jak pipety transferowe, przy użyciu kapilar iniekcyjnych Kwik-fil (1B100F-4 firmy World Precision Instruments). Wewnętrzna nić może pomóc w przecięciu otoczki szklistej. Idealne pociągnięcie daje długie, stopniowe zwężenie w cienkim odcinku, tak że można go przyciąć do pożądanej średnicy. Pipety są cięte świeżym ostrzem skalpela na folii Parafilm pod lunetą. Adapter do pipety ustnej może być wykonany z rurki Tygona o małej średnicy, nawleczonej na igłę strzykawki przymocowaną do rurki ustnej. Napełnić końcówkę pipety EGM do szerszego otworu i przetestować na pierwszej partii zarodków chitynazowanych; przyciąć końcówkę pipety, jeśli jest zbyt mała. Idealny rozmiar zależy od wieku zarodka, który chcemy uzyskać; bardzo wczesne stadia są bardziej kruche i wymagają nieco większego otworu; zarodki większe niż osiem komórek ulegają kompresji przy mniejszym uszkodzeniu i często wychodzą z większych pipet z nienaruszoną otoczką szklistą. Takie niepermeabilizowane zarodki będą się nadal rozwijać do stadium wylęgania.
Używaj strzykawki na pipecie ustnej do napełniania i czyszczenia pipet permeabilizacyjnych; rzeczywista permeabilizacja jest wykonywana przez ciśnienie powietrza w ustach. Pipety mogą siedzieć w powietrzu przez kilka godzin bez wysychania, ponieważ ich otwór jest tak mały, ale w miarę wysychania będą się w końcu zatykać. Przechowuj pipety (dobra jest warta pilnowania i wytrzyma kilka tygodni) przepłukując końcówkę kilka razy wodą destylowaną i zawieszając końcówkę pipety w probówce ze sterylną wodą destylowaną lub 0,1 M HCl, używając taśmy „flagi” na pipecie, aby nie zatonęła całkowicie.
Jeśli pipeta jest właściwa, permeabilizacja partii zarodków trwa tylko kilka minut poprzez indywidualne zasysanie ich do pipety i delikatne wydalanie. W zależności od wewnętrznej średnicy pipety, zarodki wynurzą się bardziej lub będą mniej ściśnięte, ale w ciągu kilku minut ponownie się zaokrąglą. Jeśli jest dużo lizy z permeabilizacją, to albo trawienie było niekompletne, albo otwór pipety był zbyt mały. Ponieważ błony komórkowe są dość labilne przez 4-5 minut po rozpoczęciu cytokinezy, zarodki dewitelinizowane podczas i tuż po rozszczepieniu mogą ulec rozszczepieniu lub blastomery mogą się połączyć, przechodząc później nieprawidłowe rozszczepienie tetrapolarne. Jeśli jest to krytyczne, należy sprawdzić podczas eksperymentu i wyeliminować takie zarodki.
Bardzo cienka rzęsa (tradycyjne narzędzie do mikroskopii elektronowej) zamocowana na wykałaczce z klejem jest najbardziej zadowalającym narzędziem do szybkiego ręcznego oddzielania blastomerów; szklana igła również działa, ale łatwo pęka. Rzęsy mogą być czyszczone alkoholem i chusteczką higieniczną. Blastomery ulegają rozpadowi, jeśli są oddzielane tuż po podziale; 5-10 minut po rozszczepieniu to najlepszy czas na udane manipulacje, chyba że konieczne jest wcześniejsze oddzielenie. Najłatwiejsze jest oddzielenie AB/P1. Można również oddzielić embriony czterokomórkowe. Alternatywnie, aby uzyskać blastomery P2 i EMS, P1 może być oddzielony po pierwszym podziale, a EMS/P2 po drugim. Blastomery linii P można rozpoznać po względnej wielkości i ich liniowym ułożeniu. Przy niskiej wydajności, MS, E, P3 i C mogą być oddzielone od czterech potomków początkowo izolowanego blastomeru P1. Identyfikacje komórek dokonane na podstawie ich wielkości mogą być potwierdzone przez badanie odrębnych okresów cyklu komórkowego.