Linie Drosophila
Kilka linii (GMR57C10-Gal4, elav-Gal4, UAS-GCaMP6s, UAS-GCaMP6f, UAS-CD4:tdGFP, i UAS-tdTomato) zostały uzyskane z Bloomington Stock Center. MAN-Gal4 (VT50660-AD; VT14014-DBD) i MDN-1-Gal4 (VT44845-DBD; VT50660-AD) zostały dostarczone przez B. Dicksona (Janelia Research Campus). DNa01-Gal4 (SS00731: GMR22C05-AD; GMR56G08-DBD), DNb06-Gal4 (SS02631: GMR20C04-AD; BJD113E03-DBD), DNg13-Gal4 (SS02538: BJD118A10-AD; BJD123E03-DBD), i DNg16-Gal4 (SS01543: BJD104A07-AD; BJD107F12-DBD) zostały dostarczone przez G. Rubin (Janelia Research Campus).
Generacja konstruktu Act88F:Rpr i muszek
Szczepy Act88F:Rpr (muszki Act88F:Rpr) zostały wygenerowane przy użyciu konstruktu Actin88F:eGFP29. Linia Act88F:GFP, która zawiera konstrukt eGFP napędzany przez 2053 bp region promotora actin88F, została uzyskana od R. Benton (Uniwersytet w Lozannie). Konstrukt Act88F:Rpr został wygenerowany przez zastosowanie następującej pary primerów, w celu dodania miejsca restrykcyjnego KpnI do 5′ końca klonu cDNA rpr (IP02530, Drosophila Genomics Resource Center, Bloomington, IN) i miejsca XbaI do 3′ końca otwartej ramki odczytu, za pomocą zestawu do mutagenezy ukierunkowanej QuikChange (Agilent Technologies):
Forward primer 5′ AGACGGTACCATGCAGTGCATTC 3′
Reverse primer 5′ GCCGCGTCTAGATCATTGCATGCTT 3′
Konstrukt Rpr został następnie splicowany z konstruktem Act88F:eGFP za promotorem Act88F w miejsce sekwencji eGFP. Konstrukt Act88F:Rpr wstrzyknięto do embrionów attp18 Drosophila w celu transgenezji specyficznej dla miejsca integracji PhiC3135 (miejsce lądowania transgenu cytolokacja 6C12) przez BestGene Inc. (Chino Hills, CA). W niektórych eksperymentach ten transgen był połączony z UAS-GCaMP6s-p2A-tdTomato (wygenerowany w laboratorium M.H.D.).
Obrazowanie fluorescencyjne mięśni pośredniego lotu
Wykonano mikroskopię fluorescencyjną półtoraków36,37. Krótko mówiąc, muchy były znieczulane, a następnie usuwano im głowy i odwłoki. Piersi były utrwalane przez noc w 4% paraformaldehydzie w 4 °C i płukane w 1× roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) następnego dnia. Próbki układano na szkiełku mikroskopowym, zamrażano w ciekłym azocie i przecinano w płaszczyźnie środkowo-potylicznej za pomocą żyletki. IFM były wybarwiane Falloidyną Alexa-Fluor 568 (1:100 w PBS z 0.1% Triton-X (PBST)) przez noc w 4 °C, płukane PBS i wizualizowane przy użyciu EVOS® FL Cell Imaging System (Life Technologies) przy powiększeniu ×4. Do obrazowania miofibryli IFM w całości przygotowano muszki i podzielono je na połowy, jak opisano powyżej. Powierzchnie półkoliste wybarwiono Falloidyną Alexa-Fluor 568 (1:100 w PBST) przez noc w temperaturze 4 °C. Próbki płukano w PBS, montowano za pomocą Vectashield (Vector Laboratories) i wizualizowano za pomocą mikroskopu konfokalnego Leica TCS SPE RGBV (Leica Microsystems) przy 100-krotnym powiększeniu.
Obrazowanie immunofluorescencyjne mózgów i brzusznych strun nerwowych
Mózgi i VNC zostały wypreparowane z 2-3 dpe samic much w PBS. Tkanki zostały następnie utrwalone na 20 minut w 4% paraformaldehydzie w PBS w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu mózgi i VNC były płukane 2-3 razy w PBS z 1% Triton-X-100 (PBST) przez 10 minut każdy, a następnie inkubowane w temperaturze 4 °C przez noc w PBST. Próbki umieszczano następnie w PBST z 5% normalną surowicą kozią (PBSTS) na 20 min w temperaturze pokojowej. Następnie inkubowano je z przeciwciałami pierwotnymi (królicze anty-GFP w 1:500, Thermofisher RRID: AB_2536526; mysie anty-Bruchpilot/nc82 w 1:20, Developmental Studies Hybridoma Bank RRID: AB_2314866) rozcieńczonymi w PBSTS przez 48 h w 4 °C. Mózgi i VNC płukano 2-3 razy w PBST przez 10 minut każde przed inkubacją z przeciwciałami drugorzędowymi (kozie przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi sprzężone z Alexa 488 w stosunku 1:500; Thermofisher; kozie przeciwciało drugorzędowe przeciwko myszy sprzężone z Alexa 633 w stosunku 1:500; Thermofisher) rozcieńczonymi w PBSTS przez 48 h w 4 °C. Na koniec mózgi i VNC płukano 2-3 razy po 10 min w PBST i montowano na szkiełkach z pokrywami mostkowymi w Slowfade mounting-media (Thermofisher).
Próbki obrazowano za pomocą laserowego skanującego mikroskopu konfokalnego Carl Zeiss LSM 700 z następującymi ustawieniami: ×powiększenie ×20, 8-bitowy zakres dynamiczny, 2-krotne uśrednianie obrazu, rozmiar piksela 0,52 × 0,52 μm, interwał z-krokowy 0,57 μm. Projekcje z-projekcji odchylenia standardowego objętości obrazowania wykonano przy użyciu programu Fiji38. W celu porównania ekspresji GFP w centralnym układzie nerwowym, intensywność lasera i wzmocnienia PMT dla kanału zielonego były utrzymywane na stałym poziomie w próbkach typu dzikiego, A1 > GFP i Act88F:GFP.
Obrazowanie ekspresji GFP w mięśniach nóg
Nogi były ręcznie rozcinane w stawie body-coxa i montowane na szklanych szkiełkach przy użyciu taśmy dwustronnej. Medium montażowe Slowfade (Thermofisher) zostało dodane do przestrzeni pomiędzy szkiełkiem nakrywkowym a preparatem. Następnie rejestrowaliśmy fluorescencję GFP w kanale zielonym za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego LSM 700 (Zeiss). Intensywność lasera, wzmocnienie PMT i parametry skanowania były utrzymywane na stałym poziomie u zwierząt typu dzikiego, MHC > GFP i Act88F:GFP: powiększenie ×20, 8-bitowy zakres dynamiczny, uśrednianie obrazu ×8, rozmiar piksela 0,63 × 0,63 µm i odstęp z-krokowy 10 µm. Autofluorescencja kutikuli była również rejestrowana w kanale czerwonym.
Dysekcja klatki piersiowej do obrazowania VNC
Uchwytniki używane do mocowania much podczas obrazowania zostały wykonane jak opisano wcześniej39. Do obrazowania VNC, stopnie te zostały zmodyfikowane, aby (i) mieć płaskie, a nie zagięte stalowe podkładki i (ii) sfazowane wierzchołki, aby sferyczna bieżnia była widoczna dla optycznych czujników przepływu (Shapeways, 'file’). Podkładki stalowe wykonano z 0,001″ stali nierdzewnej typu 316, miękko wyżarzonej (McMaster-Carr, część #2317K11). Podkładki wytrawiono (Etchit, Buffalo, MN), aby wygenerować prostokątne otwory, jak wyjaśniono „tutaj”. Plik projektu podkładki można znaleźć 'tutaj’.
Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na 1-3 dpe samicach much hodowanych w temperaturze 25 °C na standardowym pokarmie z mączki kukurydzianej w cyklu 12 h światło:12 h ciemność. Muszki były znieczulane w temperaturze 4 °C. Wybierano samicę muchy i w niektórych przypadkach przycinano jej skrzydła, aby ułatwić proces montażu. Następnie grzbietowa część tułowia muchy była przepychana przez otwór w stalowej podkładce w statywie do obrazowania. Następnie odwracano scenę, ostrożnie nakładano klej utwardzany promieniami UV (Bondic, Aurora, ON Canada) na obwodzie tułowia i utwardzano go w świetle UV (LED-200, Electro-Lite Co. Bethel, CT USA). Klej UV został następnie użyty do przymocowania głowy i odwłoka do spodu sceny. Scena została następnie wypełniona solą pozakomórkową18. Pod mikroskopem dysekcyjnym o dużym powiększeniu (Leica M165C), użyto igły podskórnej (30 G, BD PrecisionGlide, Franklin Lakes, NJ USA) do wycięcia i podniesienia kutikuli z grzbietowej części tułowia40, uważając, aby nie przeciąć połączenia szyjnego. Następnie, u zwierząt bez Act88F:Rpr, para tępych kleszczy została użyta do usunięcia IFM, głównie z przednio-przyśrodkowej części tułowia nad jelitami (ten krok jest zbędny u zwierząt Act88F:Rpr). Proces ten odsłania grzbietową powierzchnię proventriculus – dużej bulwiastej struktury jelitowej. Z wielką ostrożnością, para supercienkich kleszczyków została następnie użyta do uchwycenia i uniesienia żołądka, aby odsunąć znaczną część jelita (w tym plon i gruczoły ślinowe) od bardziej brzusznie położonej tkanki nerwowej. Z tak uniesionym jelitem, użyto ultracienkich nożyczek (Fine Science Tools, Foster City, CA USA) do przecięcia go w jego najbardziej przedniej części. Następnie odklejono żołądź i wykonano tylne nacięcie, aby całkowicie usunąć te części jelita, odsłaniając znajdującą się pod nimi tkankę nerwową. Należy zauważyć, że to rozcięcie usuwa również aortę, ograniczając przepływ hemolimfy z brzusznego naczynia grzbietowego. Mimo to stwierdziliśmy, że muszki były żywotne i zachowywały się przez okres do 4 h. W niektórych przypadkach zaobserwowaliśmy, że tkanka jelitowa lub mięśniowa zaczynała zasłaniać VNC podczas obrazowania. Dlatego na tym etapie należy usunąć luźną tkankę, uważając jednocześnie, by nie przeciąć VNC. Po każdej dysekcji badaliśmy stopień, w jakim zwierzę poruszało nogami w odpowiedzi na podmuch powietrza lub chwytało przedmiot każdą z nóg. Okazało się to dokładnym wskaźnikiem sukcesu preparatu. Aby ocenić jakość dysekcji, badaliśmy ruchy każdej z nóg na bieżni kulistej. Jeśli mucha mogła chodzić w sposób skoordynowany, dysekcja była uznawana za udaną. W przeciwnym razie, zwierzę było klasyfikowane jako posiadające deficyt ruchu kończyn. Zwierzęta z wieloma dysfunkcyjnymi kończynami zostały zakwalifikowane jako niezdolne.
Mikroskopia 2-fotonowa podczas zachowania
Doświadczenia były wykonywane w wieczornym czasie Zeitgebera (Z.T.) i zwierzęta były zazwyczaj obrazowane 30-60 min po dysekcji. Uchwyty na muchy zostały przymocowane do podniesionej platformy nad bieżnią sferyczną (Supplementary Fig. 3a). VNC został następnie zlokalizowany przy użyciu okularów mikroskopu i umieszczony w centrum pola widzenia przez obrazowanie 2-fotonowe.
Sferyczna bieżnia jest aluminiowym prętem z wyfrezowanym na jednym końcu22 otworem w kształcie kuli. Wytworzyliśmy kulki z pianki o średnicy 10 mm (Last-A-Foam FR-7106, General Plastics, Burlington Way, WA USA) i ręcznie nakleiliśmy je za pomocą pisaka Rapidograph (Koh-I-Noor, Leeds, MA USA), aby zapewnić cechy wysokiego kontrastu do pomiarów przepływu optycznego. Strumień 500-600 mL min-1 przefiltrowanego i nawilżonego powietrza przepuszczano przez uchwyt za pomocą cyfrowego kontrolera przepływu (Sierra Instruments, Monterey, CA USA). Ruchy kulki mierzono za pomocą dwóch optycznych czujników przepływu (ADNS3080) wyposażonych w obiektywy zmiennoogniskowe (Computar MLM3X-MP, Cary, NC USA). Piłka i mucha były oświetlane za pomocą pary diod IR LED (850-nm szczytowa długość fali) sprzężonych z włóknami optycznymi i soczewkami kolimatora (ThorLabs, Newton, NJ USA). Pomiary przepływu optycznego były przekazywane do płytki mikrokontrolera (Arduino Mega2560) i rejestrowane przy użyciu własnego kodu Python. Równocześnie, nagrania wideo zwierząt zachowujących się na piłce były wykonywane przy użyciu czułej na podczerwień kamery Firewire (Basler, Ahrensburg, Niemcy) z prędkością około 30 klatek na sekundę.
Wykonaliśmy mikroskopię 2-fotonową przy użyciu mikroskopu Bergamo II (ThorLabs) wyposażonego w dwa detektory GaAsP PMT do obrazowania GCaMP6 i tdTomato i sprzężonego z laserem Ti:Sapphire (MaiTai DeepSee, Newport Spectra-Physics, Santa Clara, CA USA) dostrojonym do 930 nm. Użyliśmy obiektywu Olympus 20× z wodną immersją i 1.0 NA (Olympus, Center Valley, PA USA). Mikroskop był sterowany przy użyciu oprogramowania ThorImage (ThorLabs). Eksperymenty obrazowania przekrojów koronowych przeprowadzono w trybie obrazowania Galvo-Galvo z częstotliwością 6-9 Hz. Częstotliwość ta zmieniała się w zależności od wielkości obrazu, który mieścił się w zakresie 26,58 × 26,58 µm i 53,15 × 53,15 µm. Moc lasera wynosiła od 3 mW do 5,7 mW. Obrazowanie wolumetryczne jest również możliwe przy użyciu odpowiedniego sprzętu (np. skanera Galvo-Resonance i kołnierza obiektywu z napędem piezoelektrycznym).
Okresowo, puff powietrza był używany do wywołania zachowań związanych z chodzeniem. Te pufy były cyfrowo kodowane (Honeywell AWM 3300 V, Morris Plains, NJ USA). Niestandardowe oprogramowanie ROS połączone przez analogowe urządzenie wyjściowe (Phidgets, Calgary, Kanada) z oprogramowaniem ThorSync (ThorLabs) było używane do synchronizacji pomiarów przepływu optycznego, wideografii behawioralnej, pomiarów puff powietrza i akwizycji obrazu 2-fotonowego. Do obrazowania przekroju koronalnego użyto kołnierza piezoelektrycznego (Physik Instrumente, Karlsruhe, Niemcy), aby kontrolować szybkie ruchy obiektywu mikroskopu w osi z.
Aby porównać aktywność neuronalną pomiędzy zwierzętami kontrolnymi i Act88F:Rpr, uzyskaliśmy obrazy 512 × 512 pikseli przy 1,7 fps używając stałej intensywności lasera i wzmocnienia PMT. Wybrane regiony obrazowania zostały empirycznie wybrane jako poziome sekcje składające się z punktów orientacyjnych obserwowanych na głębokości ~61-65 µm w Supplementary Movie 1.
Porównanie chodzenia z lub bez dysekcji
Aby ocenić wpływ dysekcji na lokomocję, zwierzęta typu dzikiego poddano następującej procedurze. Zwierzęta montowano na stopniach obrazowania i do każdego stopnia dodawano sól fizjologiczną. Tylko losowy podzbiór zwierząt został poddany sekcji. Każda zamontowana mucha była następnie umieszczana na bieżni sferycznej i jej zachowanie podczas chodzenia było rejestrowane przez 30 min. Przepływ wzrokowy rejestrowano w sposób opisany powyżej. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo lokomocji, 500 ms impuls 100% CO2 był kierowany na anteny muchy z jednominutową przerwą między impulsami (0,05 ln min-1 przy użyciu masowego kontrolera przepływu; Vögtlin Instruments, Szwajcaria).
Stymulacja anteny laserem podczerwonym
Aby porównać zachowania podczas chodzenia między Act88F:Rpr i zwierzętami kontrolnymi, stymulowaliśmy ich anteny laserem o długości fali 830 nm w bliskiej podczerwieni (Schäfter + Kirchhoff, Niemcy). Najpierw znieczuliliśmy 7-8 dpe samice w temperaturze 4 °C i zamontowaliśmy je na stopniach do obrazowania. Następnie muszki były aklimatyzowane przez 10 minut. Do każdego eksperymentu zwierzę otrzymywało dziesięć 2 s impulsów stymulacji laserowej (18,1 mW) do prawej anteny w odstępie 60 s między impulsami. Zwierzęta kontrolne i Act88F:Rpr były badane naprzemiennie, aby zminimalizować wpływ czasu okołodobowego na porównania behawioralne.
Statystyka
Rozmiary próbek do doświadczeń na zwierzętach zostały wybrane w następujący sposób: wykonaliśmy co najmniej trzy doświadczenia w celu zilustrowania populacji i skąpych zapisów neuronalnych i wykonaliśmy więcej niż dziesięć doświadczeń na grupę podczas wykonywania porównań statystycznych. Wstępnie ustalone kryterium niskiego sygnału do szumu sygnałów fluorescencji spowodowało usunięcie dwóch eksperymentów MDN z naszego zbioru danych. Nie stosowano randomizacji ani zaślepienia. W przypadku laserowej stymulacji anteny, dane nie miały rozkładu normalnego, dlatego wykonano testy Friedmana i U Manna-Whitneya. Szacunki zmienności są przedstawione jako średnie i bootstrapowane 95% przedziały ufności.
Analiza danych
Zanalizowaliśmy wszystkie dane przy użyciu niestandardowych skryptów Pythona. Ponieważ częstotliwość akwizycji danych różniła się dla przepływu optycznego, wideografii behawioralnej i obrazowania 2-fotonowego, interpolowaliśmy sygnały, aby dopasować je do tych o najwyższej częstotliwości. Następnie dane dotyczące przepływu optycznego zostały wygładzone przy użyciu średniej kroczącej (okno = 200 ms), a następnie przeliczone na obroty s-1 dla osi przednio-tylnej, przyśrodkowo-bocznej i odchylenia22. Aby uczynić te pomiary bardziej intuicyjnymi, rotacje s-1 przeliczono następnie na mm s-1 (1 rot s-1 = 31,42 mm s-1) dla ruchów przednio-tylnych (vforward) i środkowo-bocznych (vside) oraz na stopnie s-1 (1 rot s-1 = 360° s-1) dla ruchów yaw (vrotation)22.
Analizę lokomocji u rozczłonkowanych zwierząt (Supplementary Fig. 2) przeprowadzono w następujący sposób. Dane przepływu optycznego Vforward dla 20 dysekcjonowanych i 20 niedysekcjonowanych much zostały zmniejszone do 1500 punktów s-1 i wygładzone przy użyciu średniej bieżącej o czasie trwania 0,2 s. Aby obliczyć procent czasu chodzenia do przodu/tyłu lub chodzenia na boki, empirycznie zdefiniowano dwa progi, -0,31 mm s-1 i +0,31 mm s-1, w celu rozróżnienia pomiędzy staniem w miejscu a chodzeniem odpowiednio do przodu (w prawo) lub do tyłu (w lewo). Wartości powyżej 0,31 mm s-1 uznawano za momenty chodzenia do przodu (w prawo), a wartości poniżej -0,31 mm s-1 za momenty chodzenia do tyłu (w lewo). Wartości przepływu optycznego pomiędzy tymi progami uznawano za momenty stania w miejscu. Procent czasu chodzenia został obliczony jako odsetek punktów danych, w których zwierzę nie było uważane za stojące nieruchomo. Podobnie, progi 10,8 i -10,8 stopnia s-1 zostały użyte do zdefiniowania momentów skrętu. Bout został zdefiniowany jako ciągły okres chodzenia lub obracania się.
Duże deformacje tkanek mogą wystąpić podczas zachowania. Dlatego przeprowadziliśmy rejestrację obrazów pan-neuronalnych post-hoc (ryc. 2). Rejestrowaliśmy wszystkie klatki eksperymentu obrazowania do jednego obrazu referencyjnego. Ponieważ złożoność deformacji nie mogła być uchwycona za pomocą prostych parametrycznych modeli ruchu (np. przekształceń afinicznych), zastosowaliśmy nieparametryczne podejście wariacyjne, zaprojektowane do modelowania dowolnie złożonych deformacji. Obliczaliśmy pole ruchu w pomiędzy obrazem odniesienia, oznaczonym Ir, a obrazem w czasie t, oznaczonym It, rozwiązując problem minimalizacji
gdzie D(w) jest terminem dopasowania danych, drugi termin jest regularyzacją promującą gładkość w poprzez karanie jego gradientu ∇w41, Ω jest dyskretną dziedziną obrazu, a parametr λ równoważy wkład obu terminów.
Obrazy GCaMP6s stanowią wyzwanie dla estymacji ruchu, ponieważ aktywność neuronów powoduje duże lokalne zmiany intensywności. Dlatego użyliśmy dodatkowego fluoroforu niezależnego od aktywności, tdTomato, i zdefiniowaliśmy termin danych w postaci
Pierwszy człon modeluje standardowe założenie o zachowaniu intensywności wzdłuż trajektorii każdego piksela. Jest on zdefiniowany przez
gdzie używamy normy \(\ell _1\), aby uzyskać częściową odporność na zmiany intensywności42. Drugi człon w równaniu (2) jest ograniczeniem dopasowania cech, zainspirowanym przez Revaud i współpracowników43, zapisanym jako
W równaniach (2)-(4), Ir i It pochodzą z kanału tdTomato. Minimalizacja funkcji ϕ sprzyja temu, aby wektory ruchu w(x) były bliskie korespondencji cech m(x, Ir, It), obliczonej na nielicznym zbiorze odpowiednich punktów kluczowych. Uzyskujemy m za pomocą algorytmu dopasowania cech zaproponowanego przez Revaud i współpracowników43, który jest specjalnie zaprojektowany do obsługi dużych deformacji obrazu. Obliczamy m wykorzystując kanał obrazowania tdTomato, dzięki czemu korespondencje są również niewrażliwe na zmiany intensywności pomiędzy Ir i It. W rezultacie estymacja jest prowadzona na podstawie wiarygodnych dopasowań cech. Parametr γ równoważy dwa warunki w równaniu (2).
Dla każdego eksperymentu zoptymalizowaliśmy wartości λ i γ za pomocą przeszukiwania siatki w celu zarejestrowania obrazów poziomego przekroju VNC (Supplementary Fig. 4). Jako funkcję celu do optymalizacji użyliśmy gradientu czasowego średniego obrazu44. Małe wartości λ (tj. λ < 1000), sporadycznie prowadziły do artefaktów w rejestrowanych obrazach. Artefakty te związane były z silną zbieżnością pola wektorowego w(x) (Supplementary Fig. 4c). W związku z tym empirycznie zdefiniowaliśmy artefakty jako skupiska pikseli o λ < – 1.2 i kardynalności >20 (podobne wyniki uzyskaliśmy przy kardynalności >5). Ostatecznie wybraliśmy wartości λ i γ jako te, które charakteryzują się brakiem artefaktów i największym gradientem obrazu średniego. Przykładowe niezarejestrowane obrazy, pola wektorów transformacji i zarejestrowane obrazy trzech zoptymalizowanych przykładów pokazane są w Supplementary Movie 5.
Problem optymalizacji w równaniu (1) rozwiązaliśmy algorytmem ADMM (ang. alternated direction method of multiplier)45. Wprowadziliśmy dwie zmienne rozdzielające, związane odpowiednio z warunkami regularyzacji i dopasowania cech. Każdy z podproblemów algorytmu został rozwiązany analitycznie. Wykorzystano fragmenty biblioteki problemów odwrotnych opisanej w ref. 46. Post processing oparty na ważonym filtrowaniu medianowym został zastosowany przy użyciu metody z47.
Na Rys. 2, zachowania zostały półautomatycznie zanotowane przy użyciu specjalnego modułu Pythona. Moduł ten pozwala użytkownikowi na wybranie dwóch regionów zainteresowania (ROI) na pierwszej klatce filmu. Pierwszy ROI jest używany do wykrywania chodzenia i musi być umieszczony nad śródpiersiem i mezotoraką kończyn. Drugi ROI jest odpowiedzialny za wykrywanie pielęgnacji odnóży prothoracic i musi być umieszczony przed muchą. Aby wykryć ruch w tych regionach, odejmowane są kolejne klatki. Uzyskane obrazy różnicowe są następnie rozmywane medianowo (promień = 5 pikseli), w celu redukcji szumu. Na podstawie tego rozmytego obrazu, próg liczby nie-zerowych pikseli w każdym z dwóch ROI jest stosowany do wyodrębnienia binarnych sekwencji zabiegów pielęgnacyjnych i chodzenia. Należy zauważyć, że ruchy kończyn piersiowych obserwowane podczas chodzenia są ignorowane (tzn. klasyfikacja groomingu jest podporządkowana klasyfikacji chodzenia). Następnie zastosowano filtr histerezowy w celu odfiltrowania binarnych sekwencji behawioralnych i usunięcia przejść, które występują na zbyt małej liczbie klatek, aby były biologicznie wiarygodne. Przykładowe ROI i adnotacje behawioralne pokazano w filmie uzupełniającym 6. Te dane behawioralne zostały wykorzystane na ryc. 2, jak pokazano na filmie uzupełniającym 2. Został on przypisany przy użyciu następujących parametrów: próg dla chodzenia = 400, próg dla groomingu = 5, długość histerezy dla chodzenia = 8, długość histerezy dla groomingu = 10.
Dla Fig. 2b, c, użyliśmy regresji liniowej, aby znaleźć regiony w VNC związane z chodzeniem lub groomingu. Regresory Xw i Xg (odpowiednio dla chodzenia i pielęgnowania) zostały skonstruowane z dwóch sekwencji behawioralnych, Sw i Sg, przy użyciu równania (5) poprzez konwolucję z wykładniczo rozkładającym się sygnałem wapniowym Impulse Response (CIR) uzyskanym ze stałej czasowej zmierzonej dla GCaMP6s (t½ = 1,1448 s)19.
Wagi regresorów zostały obliczone przy użyciu równania (6).
gdzie y to ślad ∆F/F w skali piksela.
Rysunek 2b, c przedstawia mapy cieplne wag regresorów, ww dla chodzenia i wg dla pielęgnowania, znormalizowane do ich odpowiednich maksimów. ROI 1 został wybrany jako region mapy cieplnej z wysoką wagą dla groomingu, ale niską dla chodzenia. ROI 2 wybrano jako lokalizację przestrzenną o najwyższej wartości ww. Każdy ROI obejmuje region o promieniu 15 pikseli.
Aby zidentyfikować proces rozproszonych danych obrazowania neuronalnego (ryc. 3-5), ROI zostały najpierw wybrane przy użyciu niestandardowych skryptów Pythona, które zależały od bibliotek OpenCV i Numpy. W tym celu wybrano ramkę odniesienia, dla której oprogramowanie zidentyfikowało wszystkie potencjalne ROI. Aby to zrobić, obraz GCaMP6s został wygładzony w celu redukcji szumu tła, a następnie zastosowano do niego próg filtra Otsu. Następnie zastosowano współczynnik erozji dla wszystkich obiektów wykrytych na obrazie. Kontury wszystkich wykrytych obiektów były następnie prezentowane użytkownikowi do ręcznego wyboru. Po wybraniu referencyjnych ROI dla lewego i prawego neuronu, zastosowaliśmy algorytm rejestracji obrazu oparty na korelacji krzyżowej48 , aby zidentyfikować najbardziej prawdopodobne lewe i prawe ROI dla każdej klatki obrazu na podstawie tych, które zostały ręcznie wybrane na klatce referencyjnej. Drugi skrypt został użyty do ręcznej weryfikacji automatycznie wybranych ROI i, jeśli były nieprawidłowe, do wyświetlenia wszystkich potencjalnych ROI w obrębie ramki do ręcznego wyboru. Jeśli wartości erozji dawały nieprawidłowo ukształtowane ROI, inny skrypt był używany do ręcznego pozycjonowania eliptycznych ROI o dowolnej orientacji na danej ramce. Ostatecznie, binarne obrazy ROI zostały użyte jako maska obrazu do wyodrębnienia średnich sygnałów fluorescencji z oryginalnych obrazów GCaMP6s lub tdTomato. Sygnały te zostały przedstawione jako %∆R/R, jak w ref. 49, aby zredukować wpływ ruchu na nasze pomiary. Ze względu na brak bodźców, wartość bazowa R została obliczona jako minimalny stosunek GCaMP6s/tdTomato w ciągu 2,5 s bin.
Aby wykryć przejściowe wzrosty aktywności, opracowaliśmy algorytm oparty częściowo na ref. 50. Najpierw określiliśmy, kiedy pierwsza pochodna sygnału %∆R/R przekroczyła próg, który został określony przez zbadanie wszystkich wartości pochodnych dla danej klasy neuronów (MDN, MAN, lub A1). Uznaliśmy, że wartości progowe powinny być charakterystyczne i potencjalnie różne dla każdego typu neuronu, ponieważ dynamika fluorescencji jest związana z wewnętrznymi właściwościami fizjologicznymi, które mogą się różnić w różnych klasach neuronów, ale nie w różnych eksperymentach dla jednej klasy. Ustaliliśmy ten próg jako 97,5 percentyl dla MDNs i dMANs i 90 percentyl dla neuronów A1. Niższa wartość progowa została wybrana dla neuronów A1, ponieważ w śladach A1 zaobserwowano znacznie więcej transjentów fluorescencji. Przejścia te zostałyby przeoczone przy zastosowaniu progu 97,5 percentyla. Aby zidentyfikować początek wzrostu fluorescencji, znaleźliśmy najbliższy poprzedzający punkt czasowy, w którym pochodna przecięła zero. To przecięcie zera jest uważane za punkt czasowy „zdarzenia” związanego ze zidentyfikowanym wzrostem fluorescencji. Zdarzenia wykryte blisko siebie, bez przecinania zera przez pochodną, zostały skompresowane w jedno zdarzenie związane z pierwszym punktem czasowym. Przeprowadzono ~10 oddzielnych eksperymentów na zwierzę. Zdarzenia w pierwszych i ostatnich 10 s każdego eksperymentu nie były brane pod uwagę, ponieważ okno prezentacji danych obejmowało 10 s przed i 10 s po każdym zdarzeniu.
Ponieważ aktywność lewego i prawego MDN i dMAN silnie się kowariowała (Supplementary Fig. 5), wykonano dodatkowy krok w celu wykrycia zdarzenia: jeśli zdarzenia zostały wykryte zarówno w lewym, jak i prawym neuronie w ciągu 2 s od siebie, oba zdarzenia zostały zachowane; w przeciwnym razie zdarzenie zidentyfikowane dla neuronu A (np, lewego MDN), a nie neuronu B (np. prawego MDN), było również dodawane do biblioteki zdarzeń neuronu B.
Dla kontrastu, aktywność lewego i prawego A1 nie była silnie kowariancyjna. Dlatego zdarzenia były kojarzone z jednym, a nie z drugim neuronem. Aby to osiągnąć, jeśli zdarzenie zostało wykryte zarówno dla lewego jak i prawego neuronu A1 w oknie czasowym 0,25 s, żadne z tych zdarzeń nie zostało użyte do analizy.
Ślady %∆R/R i przepływu optycznego powiązane z każdym zdarzeniem zostały wyrównane przez ustawienie punktów czasowych zdarzeń na 0 s. Następnie obliczyliśmy średnią i bootstrapowane 95% przedziały ufności dla tych wyrównanych śladów używając biblioteki Python Seaborn. Pomiary przepływu optycznego i %∆R/R zostały zmniejszone do 500 wartości s-1 dla tej analizy. Aby zwiększyć przejrzystość, ślady %∆R/R zostały odjęte od linii bazowej, aby wyzerować je w czasie zdarzenia w panelach podsumowujących (Rys. 3d, 4d i 5d, e). Kontrolne, przemieszane dane (szare ślady) zostały obliczone poprzez przypisanie losowych punktów czasowych w miejsce prawdziwych, zidentyfikowanych zdarzeń. Te losowe punkty czasowe były traktowane jako prawdziwe zdarzenia, a ich średnia i bootstrapowane 95% przedziały ufności zostały obliczone i wykreślone dla porównania.
Analiza kowariancji (Supplementary Fig. 5) została wykonana przy użyciu niestandardowego skryptu Pythona, który zależał od bibliotek Matplotlib i Numpy. Wykresy rozrzutu zostały obliczone w celu porównania wartości %∆R/R lewego i prawego neuronu ze wszystkich eksperymentów dla każdej muchy osobno. Wartości r Pearsona są podane jako średnia ± odchylenie standardowe.
Zachowania związane ze zdarzeniami (filmy uzupełniające 8, 10, 12 i 13) zostały ręcznie wybrane z automatycznie wykrytych zdarzeń, jak opisano powyżej. Dla dMANs, zdarzenia były wybierane spośród tych, które maksymalizowały różnicę w przednio-tylnych obrotach kuli pomiędzy 1 s przed i 2 s po zdarzeniu. W przypadku MDNs, zdarzenia były wybierane spośród tych, które minimalizowały przednio-tylne obroty kuli do 2 s po zdarzeniu. Dla neuronów A1, zdarzenia zostały wybrane spośród tych, które zmaksymalizowały średnie obroty kuli yaw (pozytywne dla przykładów lewego neuronu A1 i negatywne dla przykładów prawego neuronu A1) do 2 s po zdarzeniach.
Na Rys. 8 uzupełniającym, odpowiedzi na stymulację laserem w bliskiej podczerwieni zostały uśrednione dla 10 prób dla każdego zwierzęcia. Przepływ optyczny został zdipróbkowany do 500 wartości s-1. Średnie i 95% bootstrapowane przedziały ufności dla śladów przepływu optycznego zostały zmierzone i wykreślone przy użyciu biblioteki Python Seaborn. Biblioteka Python Scipy została użyta do wykonania testów Friedmana i U Manna-Whitneya.