Evolution and conservation of polycomb repressive complex 1 core components and putative associated factors in the green lineage

PRC1 core component: RING1

PRC1 Białka RING finger składają się z dwóch kladów (plik dodatkowy 2), RING1 i BMI1, z których oba charakteryzują się konserwowaną kombinacją domen RING i Ring-finger And WD40 associated Ubiquitin-Like (RAWUL) (ryc. 2 i 3). Aktywność ligazy ubikwitynowej pisarzy kompleksu PRC1 opiera się na ich domenie RING. U zwierząt RING1b jest kluczowym pisarzem H2Aub, podczas gdy RING1a odgrywa mniejszą rolę. BMI1 nie wykazuje aktywności ligazy E3, ale może stabilizować i wzmacniać funkcje RING1b. W Arabidopsis, zarówno rodziny AtRING1a/b jak i AtBMI1a/b/c mogą katalizować H2Aub. Na etapie wegetatywnym, AtRING1a/1b może hamować przejście od fazy wegetatywnej do embrionalnej oraz ektopowe tworzenie merystemu, głównie poprzez tłumienie błędnej ekspresji głównych regulatorów embrionalnych i regulatorów komórek macierzystych, odpowiednio. Na etapie reprodukcyjnym, podwójny mutant Arabidopsis ring1a;ring1b wykazuje bardzo dużą liczbę organów kwiatowych i silne fenotypy wykazujące dramatyczny obrzęk gynoecium i całkowitą sterylność. Zarówno AtRING1a, jak i AtRING1b mogą kontrolować utrzymanie kwiatowych komórek macierzystych i prawidłowy rozwój kielicha poprzez hamowanie ekspresji KNOX-I. Mutacja RING1a/b może powodować wczesne przejście w fazę wegetatywną poprzez regulację statusu H2Aub w locus SPL .

W drzewie filogenetycznym roślinne białka RING1 można podzielić na trzy gałęzie: rośliny nasienne (Grupa-I), mchy i paprocie (Grupa-II) oraz glony (Grupa-III, Rys. 2). Pokrewieństwo filogenetyczne homologów RING1 jest zgodne z ewolucj± ro¶lin. RING1 przeszedł jedną i dwie duplikacje, odpowiednio u przodków eudicot i monocot. Większość białek RING1 występuje w dwóch kopiach u każdego gatunku, ale PtRING1 i ZmRING1 występują w czterech kopiach, a BrRING1 w trzech. Zdarzenie duplikacji może jednak nastąpić po rozdzieleniu się jednoliściennych i dwuliściennych. Białka RING1 u eudikotyli wykazuj± podobn± organizację domen (ryc. 2). Białka RING1 u jednoliściennych reprezentowane są tylko przez Poaceae, wykazując niewiele zmiennych organizacji domenowych. Typowa domena RING, POU, która jest dwudzielną domeną wiążącą DNA, oraz Ras Exchanger Motif występują również w ZmRING1a, białku Agrobacterium VirD5, a domeny powtórzeń spektryny wykazują w BdRING1b. Domena prionowa występuje w OsRING1b. Co intrygujące, domena POU została po raz pierwszy zidentyfikowana u roślin. Grupa-II występuje u paproci i Physcomitrella patens, natomiast grupa-III u dwóch alg. Jednak obie te grupy są dobrze zachowane w organizacji domen.

Komponent rdzeniowyPRC1: BMI1

Trzy białka BMI1-podobne, AtBMI1a, AtBMI1b i AtBMI1c występują w Arabidopsis . Niedobór BMI1 (podwójny mutant atbmi1a;atbmi1b) powoduje embrionalną strukturę w stadium wegetatywnym i dużą liczbę organów kwiatowych w stadium reprodukcyjnym, cechę podobnie stwierdzoną u podwójnego mutanta ring1a;ring1b . Podobnie do białek RING1, BMI1a/1b funkcjonuje jako pisarze PRC1 dla H2Aub, koordynując z PRC2-mediowaną H3K27me3 w celu utrzymania tożsamości komórek. AtBMI1a/1b funkcjonuje jako ligazy E3 ubikwityny i jest zaangażowany w odpowiedź na suszę. MIR156A i MIR156C są również genami docelowymi AtBMI1, regulującymi przejście od warzyw do rozwoju produkcyjnego. W szczególności, AtBMI1c działa jako gen imprinted, który wyraża matczyne allele w bielmie, ale biallelowe w pręciku. Białka BMI1 można zidentyfikować u wszystkich roślin i u algi Volvox carteri, ale nie u alg Ostreococcus lucimarinus czy Chlamydomonas reinhardtii; ponadto BMI1 dzielą się na dwie grupy, mianowicie homologi BMI1a/1b i BMI1c (ryc. 3). Wszystkie BMI1s zawierają wysoce konserwowane domeny RING i RAWUL, z wyjątkiem BsBMI1a, PtBMI1d i OrBMI1b, przy czym OrBMI1b nie posiada domeny RAWUL. Długość sekwencji BMI1s zwykle mieści się w przedziale 350-550 aa, ale FvBMI1c zawiera 974 aa reszt z nadmiernie wydłużonym C-końcem. U roślin dwuliściennych występują trzy kopie BMI1, z wyjątkiem topoli i bawełny – pięć kopii, a u pomarańczy – dwie kopie. Wszystkie białka BMI1a/1b wykazuj± podobn± organizację domen, ale ThBMI1b posiada inny motyw wi±ż±cy fosforan TIM, przylegaj±cy do domeny RING; ponadto BdBMI1d posiada elastyczny motyw zawiasowy białek SMC (Structural Maintenance of Chromosomes), który odpowiada za dimeryzację DNA i jest istotnym czynnikiem determinuj±cym dynamiczne oddziaływania SMC-DNA. Wysoce konserwatywny AtBMI1c i jego homologi występują tylko u Crucifera (ryc. 3).

Domena RAWUL została po raz pierwszy zidentyfikowana w białkach PRC1 RING finger, rodzinach RING1 i BMI1, i jest konserwowana w roślinach i robakach. Domena RAWUL może być zaangażowana w regulację epigenetyczną poprzez wiązanie się z PRC1 lub innymi czynnikami. U ssaków wykazano, że RAWUL wi±że się z homologami Ph, choć zjawisko to nie zostało dotychczas potwierdzone. Domena RAWUL może więc wi±zać się z innymi białkami zaangażowanymi w ubikwitynację histonów. Sanchez-Pulido i wsp. zasugerowali, że niektóre inne białka wykazuj± funkcje ubikwitynacji histonów PRC1. Arabidopsis HTA10 wykazuje konserwatywną sekwencję konsensusu PKKT. Kukurydziane ubikwitynowane H2A może być zaangażowane w ubikwitynację H2A. Zbożowe białko RAWUL Gnp4/LAX2 reguluje długość ziarna za pośrednictwem szlaku sygnalizacji auksynowej poprzez interferencję z OsIAA3-OsARF25 . Domena RAWUL może tworzyć moduł interakcji białko-białko z domeną PAL N-końca AL6, która jest czynnikiem stowarzyszonym z PRC1 .

Domena RAWUL nie jest wysoce konserwowana między zwierzętami i roślinami. Jednak analiza dopasowania sekwencji homologów RING1a/1b pokazuje, że domeny te są w znacznym stopniu konserwowane od roślin niższych do wyższych, a w BMI1a/1b/1c brakuje domeny β5. Białka RING (BrRING1b, ZmRING1b i SmRING) oraz białka BMI1 (AtBMI1c, BsBMI1a, OrBMI1b i VcBMI) nie zawierają domen RAWUL (ryc. 2 i 3, plik dodatkowy 3). Domeny RING i RAWUL są prawdopodobnie domenami specjalnymi dla rodzin RING1 i BMI1.

PRC1 Core component: LHP1

W Arabidopsis, LHP1, aktywator i represor transkrypcji, został po raz pierwszy zidentyfikowany jako homolog Drodophila Heterochromatin-associated Protein 1 (HP1), który wiąże się z markerami H3K27m3 ustalonymi przez PRC2 i katalizuje monoubikwitynację na lizynie 119 histonu H2A . LHP1 może pełnić analogiczną rolę do muchowego Pc w kompleksie PRC1-podobnym. LHP1 zawiera dwie typowe domeny, domenę Chromatin Organization Modifier (CHROMO), która jest niezbędna dla specyficzności wiązania H3K27me3 oraz domenę Chromo Shadow (ChSh). W przeciwieństwie do swojego zwierzęcego odpowiednika, LHP1 jest zlokalizowany głównie w obrębie euchromatyny. Lokalizacja i retencja Fern LHP1 są kontrolowane przez różne domeny, a jej retencja w nukleolu i chromocentrach jest zapewniona przez domenę ChSh. P. patens PpLHP1 oddziałuje z PpCMT poprzez ich domeny chromo . Jako czytnik PRC1 w roślinach, LHP1 kontroluje wiele ścieżek rozwojowych związanych z rozwojem organów, wielkością komórek i przejściami faz wegetatywnych do reprodukcyjnych .

LHP1 homologi również podlegają ewolucji roślin. Poza wyróżnionymi domenami CHROMO i ChSh, niektóre LHP zawierają inne odrębne motywy (ryc. 4). Na przykład, LHP1 topoli mają dodatkową domenę CDC37 na N-końcu, a AtLHP1 zawiera dodatkową domenę B5 występującą w podjednostkach β syntetazy fenyloalaniny-tRNA. OsLHP1 zawiera kolejną domenę Peptide Chain Release Factors związaną z rodziną białek; ponadto domena ta odgrywa ważną rolę w nowo syntetyzowanych łańcuchach polipeptydowych uwalnianych z peptydylo-tRNA. BdLHP1 zawiera kolejne białko błonowe ER SH3, które jest związane z chaperonami zlokalizowanymi w błonie. PpLHP1 zawiera dodatkową domenę ostepontyny.

Faktor związany z PRC1: EMF1

EMF1 i VRN1 występują specyficznie u gatunków dwuliściennych . Zarówno EMF1 jak i VRN1 są białkami wiążącymi DNA, które regulują ekspresję genów podczas rozwoju organów kwiatowych. Aubert i in. uznali EMF1 za nowe białko zaangażowane w kontrolę architektury pędu i kwitnienia u Arabidopsis; ponadto, mutacje EMF1 typu loss-of-function powodują przyspieszone przejście od rozwoju embrionalnego do reprodukcyjnego. EMF1 i EMF2 uczestniczą w wyciszaniu genów homeotycznych kwiatów przez PcG i są kluczowe dla rozwoju wegetatywnego. EMF1, ATX1 i ULT1 mogą współpracować w celu utrzymania integralności chromatyny i zapobiegania przedwczesnej ekspresji genów w nasionach po kiełkowaniu. EMF1 jest związany z czytnikiem H3K27me3, który jest wymagany dla H3K27me3 . EMF1, LHP1 i demetylaza histonu H3 lizyny-4 mogą tworzyć kompleks EMF1c, aby odgrywać ważne role w regulacji MIR172 i kwitnienia Locus T (FT) .

Każdy gatunek posiada pojedynczy gen homologiczny EMF1 z wyjątkiem ogórka, bawełny i Eutrema z dwoma, a kapusta z czterema. Analiza filogenetyczna wykazuje, że EMF1 są dobrze zachowane w dwuliściennych, ale może brakować reprezentatywnych lub nienaruszonych domen w bazie danych Pfam i SMART. Wyrównanie sekwencji białek sugeruje istnienie sześciu konserwowanych motywów, zwłaszcza motywu 4, 5 i 6 (ryc. 5, plik dodatkowy 4), których funkcje nie są znane.

Faktor związany zPRC1: VRN1

VRN1 i VAL1/2/3 są specyficznymi dla roślin składnikami PRC1 i stanowią podklady specyficznej dla roślin rodziny czynników transkrypcyjnych z domeną B3 (Additionalfile 5). Podobnie jak EMF1, geny VRN Arabidopsis mog± pośredniczyć w wernalizacji i odgrywaj± główn± rolę w przej¶ciu z fazy wegetatywnej do reprodukcyjnej w odpowiedzi na przedłużone traktowanie zimnem. VRN1 lokalizuje się w j±drze i jest sekwencyjnie niespecyficzny pod względem wi±zania DNA, ukierunkowania na FLC i FT2 . Mutanty Loss-of-function wykazują podobne fenotypy do innych mutantów PRC1.

VRN1 i jego homologi są pogrupowane w dwa klady, AtVRN1a/RTV1 i AtVRN1b/1c/1d. Domena B3 jest prawdopodobnie specjalną domeną rodziny VRN1 (71, ryc. 6). AtVRN1, który w tym badaniu nazwano AtVRN1a, charakteryzuje się dwiema domenami B3, występuje tylko u wyższych gatunków roślin i specyficznie wiąże się z DNA. W obecnym badaniu, pięć homologów VRN1 zostało zidentyfikowanych w Arabidopsis, a wiele homologów zostało również znalezionych w innych roślinach dwuliściennych przez BlastP. Organizacja domen wykazała, że AtVRN1a i jego homologi składają się z dwóch domen B3 (Rys. 6). AtRTV1, AtVRN1b/1c/1d i ich homologi głównie w grupie II wykazuj± utratę drugiej domeny B3, która może być istotna dla ich funkcji. Domena ta jest zastępowana przez superrodzinę BfiI_C_EcoRII_N_B3, która zawiera N-końcową domenę wiążącą DNA białek endonukleaz typu IIE o ograniczonej aktywności EcoRII, C-końcową domenę wiążącą DNA białek endonukleaz typu IIS o ograniczonej aktywności BfiI oraz specyficzne dla roślin białka B3.

czynnik stowarzyszony z PRC1: VAL1/2/3

Białka VAL, które zostały zidentyfikowane jako represor transkrypcyjny, są wymagane do globalnej represji ekspresji genów embrionalnych . Siewki podwójnego mutanta va l1 val2 mogą tworzyć embriopodobne proliferacje w korzeniach i merystemie wierzchołkowym, ale nie w liściach. Mutanty val2/val3 wykazują podobne efekty dominujące w roślinach mutantów homozygotycznych val1. W mutantach val1, 39% transkryptów w regulatorze FUSCA3 jest obniżonych, podczas gdy podstawowe czynniki transkrypcyjne sieci LAFL nie są obniżone. Wszystkie przypuszczalnie ukierunkowane transkrypty VAL1 działają poprzez epigenetyczną i/lub transkrypcyjną represję. Dodatkowo, VAL1 i VAL2 są zaangażowane w wernalizację za pośrednictwem PcG. Białka VAL współpracują z BMI1, aby pośredniczyć w monoubikwitylacji H2AK119 i inicjować represję genów dojrzewania nasion. Białka VAL pośredniczą w represji poprzez rekrutację kompleksu deacetylazy histonowej do genów LEC1/AFL. VAL1 represjonuje transkrypcję FLC poprzez promowanie deacetylacji histonów . VAL1 reguluje AGL15 poprzez odkładanie H3K27me3 w sekwencjach upstream AGL15 .

Z wyjątkiem domen B3 i zf-CW, które są możliwymi specjalnymi domenami dla rodziny VAL1/2/3, większość homologów VAL1/2/3 niesie dodatkowe motywy palca cynkowego, takie jak PHD i ZnF-GATA, na 3′-końcu (ryc. 7). Domena VAL1-B3 jest niezbędna do interakcji z kanonicznym elementem Sph/RY w obrębie AGL15 i FLC. Domena zf-CW jest członkiem modułów czytnika modyfikacji histonów do regulacji epigenetycznej. W obecnym badaniu rodzina VRN1 występuje tylko w dwuliściennych (ryc. 6), a jej homologi zawierają jedną lub dwie domeny B3. Natomiast białka VAL1/2/3 występują od alg do okrytozalążkowych i mają tylko jedną domenę B3. Ponadto, białka VAL1/2/3 można podzielić na trzy grupy (ryc. 7). Grupa-I zawierająca homologi VAL1 występuje tylko u dwuliściennych; Grupa-II zawierająca homologi VAL2 i Grupa-III zawierająca homologi VAL3 występuje zarówno u dwuliściennych jak i jednoliściennych. Jak wskazują nasze wyniki Alga i paproć wykazują tylko jedno białko homologiczne do VAL, podczas gdy mech wykazuje pięciu członków, a O. lucimarinus żadnego.

Faktor związany z PRC1: AL1-7

BiałkaAL, niosące konserwowaną domenę PHD, zostały zidentyfikowane jako czynnik transkrypcyjny . Białka Alfin Arabidopsis są uważane za czytniki H3K4me2/3 i funkcjonują jako nowi partnerzy AtRING1 i AtBMI1. Białka AL są zaangażowane w wiele procesów rozwojowych, m.in. zwiększają ekspresję MsPRP2 w korzeniach lucerny i przyczyniają się do tolerancji na sól. W Arabidopsis, zarówno AL1 jak i AL5 mogą wiązać się do regionów promotorowych genów docelowych i tłumić wiele negatywnych czynników w celu nadania tolerancji na stres abiotyczny. Arabidopsis AL6 jest zaangażowany w regulację ekspresji transkryptów związanych z wydłużaniem się korzeni w warunkach głodu fosforanowego; ponadto proces ten jest wynikiem działania jego domeny PHD, która może wiązać się z H3K4me3, co jest strategią regulacji epigenetycznej w warunkach niskiej dostępności fosforanów. Jednakże AtAL7 odgrywa negatywną rolę w tolerancji na sól. W obecnym badaniu rodziny AL i ING mają wspólną domenę PHD, a drzewo filogenetyczne pokazuje, że należą one do różnych gałęzi, co sugeruje ich bliskie pokrewieństwo (plik dodatkowy 6). Rodzina ALs jest największą rodziną czynników związanych z PRC1. Arabidopsis zawiera siedem ALs, które można podzielić na trzy grupy: AtAL1/2, AtAL3/4/5 i AtAL6/7. W obecnej pracy białka AL roślin nasiennych zostały podzielone na trzy grupy, mianowicie: grupa-I (AL1/2), grupa-II (AL3/4/5) i grupa-III (AL6/7). Białka AL roślin zarodnikowych znajdują się w dolnej części drzewa filogenetycznego (ryc. 7). Kukurydza i bawełna zawierają więcej członków białek AL niż inne gatunki.

Z wyjątkiem FvAL5, który obejmuje 687aa z trzema domenami Alfin i jedną domeną PHD, większość roślin jest niezwykle konserwatywna w organizacji domen, to jest jedna domena Alfin i PHD, i wykazują długość sekwencji około 230-300aa. (Ryc. 7, plik dodatkowy 1). Jedna domena Alfin i PHD, specjalna domena dla rodziny AL, są rozmieszczone na N- lub C-końcu białek. Motyw PAL, znajdujący się w domenie Alfin, białek AL2 i AL7 może wiązać się z RING1 i BMI1 . Białka PHD-finger występują powszechnie u eukariontów i pełnią kluczową rolę w regulacji transkrypcji i struktury chromatyny. Palec PHD jest wymagany do wiązania H3K4me3/2 w rodzinach AL i ING .

czynnik związany zPRC1: ING1/2

Białka AL występują tylko u roślin, natomiast białka ING są szeroko rozpowszechnione u drożdży, zwierząt i roślin. ING zostało po raz pierwszy zidentyfikowane u ssaków, a wszystkie pięć białek ING może wiązać się do H3K4me3/2 poprzez palce PHD i działać jako składniki modyfikacji histonów. Białka te były jednak rzadko badane u roślin. Podobnie jak białka AL, konserwowane białka AtING mogą rozpoznawać H3K4me3/2 za pośrednictwem palców PHD, podczas gdy funkcje biologiczne AtING są nieznane .

Większość roślin zawiera dwa geny ING (ryc. 8). Białka ING posiadają N-końcową domenę ING, która wiąże się z niezmodyfikowanymi ogonami H3, oraz C-końcową domenę PHD, która jest niezbędna do wiązania H3K4me2/3 . W przeciwieństwie do poprzednich prac, zidentyfikowaliśmy homologi VcING1/2, OlING1 i CrING1/2 u zielenic. Palce PHD w VcING2 i CrING2 s± zast±pione przez domeny Tudora, które również s± zaangażowane w interakcje białko-białko. Domena Tudor może wiązać się z symetrycznie dimetylowanymi argininami sekwencji bogatych w argininę i histonem H4 dimetylowanym na Lys20 .

Czynnik związany z PRC1: EBS/SHL

EBS i SHL są białkami zawierającymi domenę BAH , które występują tylko w królestwie roślin i są szeroko rozpowszechnione od roślin niższych do wyższych (Rys. 1, ). Białka EBS Arabidopsis są negatywnymi regulatorami transkrypcji, a mutacje ebs powodują fenotypy wczesnego kwitnienia. EBS i SHL wiążą się z różnymi integratorami kwiatowymi, przy czym EBS reguluje FT, a SHL represjonuje SOC1. EBS i SHL działają redundantnie w regulacji spoczynku nasion. EBS/SHL są czytnikami H3K27me3, które mogą również wiązać H3K4me3.

Białka EBS/SHL, podgrupowane do dwóch kladów (grupa-I homologów EBS i grupa-II homologów SHL). Grupa-I występuje u roślin wyższych, natomiast grupa-II tylko u okrytozalążkowych. Trzy homologi EBS, PpEBSe/d/f z mchu i homologi EBS/SHL z glonów znajdują się w dolnej części drzewa filogenetycznego. Większość gatunków posiada pojedynczą kopię SHL, ale wiele kopii EBS, jak to opisano u topoli, bawełny i mchu (Rys. 1 i 9). Białka EBS/SHL s± wysoce konserwatywne pod względem długo¶ci, która waha się od 199 do 336 aa (większo¶ć ma około 220 aa), oraz organizacji domen, N-końcowej domeny BAH i C-końcowej domeny PHD (Rys. 9). Palec PHD związany jest z H3K4me2/me3, a domena BAH odczytuje znak H3K27me2/me3. Ogólnie rzecz biorąc, H3K4me3 koreluje z aktywacją transkrypcyjną, podczas gdy H3K27me3 z wyciszaniem genów u roślin i zwierząt. EBS posiada domenę BAH i domenę PHD, które odczytują i oddziałują odpowiednio na znaczniki H3K27me2/me3 i H3K4me/me3. Co więcej, to domena BAH, a nie palec PHD, pośredniczy w interakcji SHL lub EBS z EMF1. Interakcje BAH-H3K27me3 i PHD-H3K4me3 są ważne dla SHL-mediowanej przez SHL represji kwiatowej. EBS/SHL równoważy aktywne i represyjne stany chromatyny.

.