Wskazania do stosowania PCR 16S rDNA o szerokim zakresie
PCR 16S rDNA o szerokim zakresie może wykrywać zarówno bakterie żywe, jak i nieżywotne, podobnie jak qPCR. Jest ona również przydatna klinicznie, gdy inne techniki dają wyniki ujemne, na przykład w hodowlanym zapaleniu wsierdzia, septycznym zapaleniu stawów, zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych lub zakażeniach długich linii.8 11 Zidentyfikowane bakterie są często niezwykłe, rzadkie, trudne do wyhodowania lub bakterie, dla których specyficzny PCR nie jest dostępny.8 9 Przykłady obejmują identyfikację Helicobacter sp jako podstawowej przyczyny zapalenia kości i szpiku kostnego lub Neisseria meningitidis jako nieoczekiwanej przyczyny septycznego zapalenia stawów za pomocą PCR o szerokim zakresie 16S rDNA, po uzyskaniu negatywnych wyników z innych technik diagnostyki mikrobiologicznej.12 13
Możliwe jest również dokonanie rozróżnienia pomiędzy gatunkami: Ureaplasma spp składa się z dwóch szczepów bakteryjnych, Ureaplasma parvum i Ureaplasma urealyticum, nierozróżnialnych w hodowli, a każdy z nich podejrzewany jest o wywoływanie innej patologii u noworodków.7 14 15 PCR o szerokim zakresie 16S rDNA, a następnie sekwencjonowanie, umożliwiło zróżnicowanie i identyfikację obu gatunków, wspomagając badania nad patogennością specyficzną dla danego gatunku.8 16
Dodatkowo, PCR o szerokim zakresie 16S rDNA może zidentyfikować wcześniej niescharakteryzowane bakterie. Szerokozakresowa PCR 16S rDNA umożliwiła identyfikację Bartonella henselae i Tropheryma whippelii jako patogenów leżących u podstaw odpowiednio choroby kociego pazura i choroby Whipple’a.17 18
Jednakże, szeroki zakres 16S rDNA PCR sprawia, że jest ona podatna na kontaminację. Amplifikowane jest całe bakteryjne DNA obecne w próbce, łącznie z tym, które jest nieuchronnie obecne w odczynnikach, co oznacza, że niemożliwe jest całkowite wyeliminowanie niskiego poziomu zanieczyszczenia środowiska. Przy dużej liczbie cykli termicznych to zanieczyszczone DNA o niskim poziomie tła ulegnie amplifikacji i da wynik fałszywie dodatni. Aby zmniejszyć to ryzyko, należy przeprowadzić sekwencjonowanie w celu odróżnienia prawdziwego patogenu od zanieczyszczeń (często bakterii przenoszonych drogą wodną, których prawdopodobieństwo wywołania choroby jest bardzo niskie). Przy użyciu standardowych technik sekwencjonowania można zidentyfikować tylko najbardziej dominującą sekwencję DNA, co oznacza, że w próbkach, w których obecny jest więcej niż jeden gatunek bakterii (takich jak stolec), wyniki są niemożliwe do zinterpretowania. Oznacza to, że PCR o szerokim zakresie 16S rDNA ze standardowym sekwencjonowaniem nie jest przydatny w przypadku próbek z miejsc niesterylnych.
Aby jeszcze bardziej zmniejszyć ryzyko przytłoczenia przez zanieczyszczenie, liczba cykli termicznych jest zmniejszona w porównaniu ze specyficznymi qPCR, ale ma to równoczesny skutek w postaci zmniejszenia czułości.19 Oznacza to, że PCR o szerokim zakresie 16S rDNA zawsze będzie mniej czuły niż dobrze zaprojektowany specyficzny qPCR do rzędu 1-2 log. Ostatnią wadą jest to, że metody te mogą być ograniczone do laboratoriów badawczych lub specjalistycznych, co oznacza, że próbki mogą wymagać wysłania, co wydłuża czas oczekiwania.16 Porównanie kluczowych zalet i wad metod hodowlanych, qPCR i PCR 16S rDNA o szerokim zakresie przedstawiono w tabeli 1, a schemat sugerowanych badań w przypadku podejrzenia bakteryjnego zakażenia miejsca sterylnego z zastosowaniem zarówno qPCR jak i PCR 16S rDNA o szerokim zakresie przedstawiono na rycinie 1C.
Podsumowując, PCR o szerokim zakresie 16S rDNA jest istotnym uzupełnieniem diagnostyki mikrobiologicznej jako druga linia, gdy istnieje duże podejrzenie zakażenia miejsca sterylnego, ale hodowla i qPCR dla najbardziej prawdopodobnych patogenów dały wynik ujemny. Ze względu na ryzyko wykrycia kontaminacji bakteryjnego DNA, wykonuje się mniej cykli PCR niż w przypadku qPCR, co skutkuje mniejszą czułością testu, dlatego qPCR powinien być stosowany w pierwszej kolejności (ryc. 1C). W badaniach, 16S rDNA PCR będzie nadal wykorzystywany do identyfikacji nowych gatunków bakterii, określania patogenności specyficznej dla danego gatunku oraz jako złoty standard do porównań przy ocenie nowych testów. Jest ona również stosowana w połączeniu z najnowocześniejszymi technikami, takimi jak sekwencjonowanie następnej generacji. Stosuje się je do charakteryzowania złożonych populacji drobnoustrojów w jelitach, stolcu, pochwie, łożysku, płucach i w środowisku.20 W miarę jak sekwencjonowanie następnej generacji oparte na PCR o szerokim zakresie 16S rDNA staje się coraz tańsze i szerzej dostępne, techniki te mogą potencjalnie umożliwić stosowanie terapii dostosowanej do indywidualnych potrzeb, w miarę jak wzrasta nasze zrozumienie złożonych interakcji między nami a naszymi społecznościami drobnoustrojów.21 Na przykład szerokozakresowa PCR 16S rDNA PCR społeczności mikrobiomu jelitowego zidentyfikowała wyraźne zmiany w takich stanach, jak HIV, przedwczesny poród noworodków i niedożywienie.22-24 Ponieważ badamy potencjalne możliwości terapeutyczne ujawnione w tych różnorodnych stanach, jest prawdopodobne, że szerokozakresowa PCR 16S rDNA będzie kamieniem węgielnym dalszych badań.
.