Tetramisolo (Sigma T1512, una soluzione stock di 10 mg/mL in H2O diluita a circa 100 μg/mL in sali d’uovo) l’aggiunta è opzionale; questo farmaco paralizza i vermi e rende il taglio più facile. Tagliare immediatamente: se troppo contratto, i vermi non rilascerebbero molte uova. Usare una lama di bisturi nuova ogni giorno, perché si corrodono rapidamente. Un eccesso di tetramisolo provocherà la formazione di un precipitato nella soluzione di NaOCl.
Per la massima resa, si possono rilasciare più uova trattando i vermi tagliati per circa 1 minuto con un volume uguale di soluzione di NaOCl aggiunta direttamente alla goccia di taglio. Non appena le uova vengono rilasciate, aggiungere lo stesso volume di EGM come NaOCl utilizzato per prevenire ulteriori danni alle uova. Questo trattamento ucciderà le fasi pronucleari e danneggerà gli embrioni a una cellula. Il trattamento NaOCl di 3 minuti è ancora necessario prima di trattare con chitinasi per una digestione uniforme. Per le uova prima dello stadio di due cellule, in cui il guscio è ancora un po’ permeabile, aggiungere un volume uguale di EGM non appena i vermi vengono tagliati. Dopo questo, molti possono sopravvivere ai 3 minuti di NaOCl e al trattamento con chitinasi, e alcuni saranno ancora allo stadio di una cellula dopo il trattamento con chitinasi e la rimozione dell’involucro vitellino se si lavora velocemente.
Pipette di trasferimento soddisfacenti sono fatte da SMI micropipettatore da 5 a 30 μL capillari (Fisher 21-380-9C) o World Precision Instruments capillari da 4 pollici (1B100F-4), tirando a doppio sopra una fiamma molto piccola. Questo viene fatto prima riscaldando e tirando delicatamente per fare una sezione centrale sottile, poi raffreddando brevemente, e poi riscaldando più delicatamente mantenendo il capillare sotto tensione per il tiro finale. Il tiro ideale produce una pipetta con un gambo distinto e una sezione stretta e gradualmente affusolata di circa 3/4-1 pollice. Un piccolo bruciatore a gas può essere realizzato montando un grande ago da siringa in un tappo di sughero, con un morsetto a vite sul tubo per regolare il flusso di gas. In alternativa, le pipette di dimensioni coerenti possono essere fatte tirando su un estrattore automatico. Prima dell’uso, rompere il capillare alla punta desiderata, circa 100-150 μm (tre o quattro volte il diametro dell’uovo) pizzicando tra l’unghia del pollice e la punta delle dita o utilizzando una lama di rasoio sotto un microscopio da dissezione. Un microscopio Microforge può aiutare a fare pipette coerente anche se non è necessario. Mantenere il diametro della pipetta piccolo per ridurre al minimo il trasferimento di liquido. Se le uova si attaccano all’interno della pipetta, molti possono essere recuperati dal lavaggio con la soluzione NaOCl o il EGM come si va avanti. Aspettatevi di cambiare spesso le pipette, e abbiate una buona scorta prima di una sessione di lavoro.
Se la digestione della chitinasi non funziona entro 8 minuti, probabilmente non funzionerà affatto. I problemi più comuni sono l’ipoclorito o lo stato fisiologico dei vermi (la deposizione del primo giorno sembra dare uova più dure). L’ipoclorito dovrebbe essere una partita non scaduta, e di solito diventa povero un mese circa prima della data di scadenza. Tenere il brodo refrigerato in una bottiglia scura e ventilata, riempita quasi fino alla cima. Mescolare una provetta da 3 ml appena prima di iniziare e tenerla in ghiaccio; funzionerà per circa 3 ore e poi dovrebbe essere sostituito.
Dopo il trattamento enzimatico e soprattutto dopo la permeabilizzazione, gli embrioni sono abbastanza appiccicosi e si raggruppano; questo può essere minimizzato pipettando uno o solo pochi alla volta. Piccoli grumi possono essere rotti espellendo dalla pipetta con un po’ di forza alcune volte.
Le pipette di permeabilizzazione sono tirate a mano nello stesso modo delle pipette di trasferimento, usando i capillari di iniezione Kwik-fil (1B100F-4 della World Precision Instruments). Il filo interno può aiutare a tagliare l’involucro vitellino. La trazione ideale dà una lunga conicità graduale nella sezione sottile in modo che possa essere tagliata al diametro desiderato. Le pipette sono tagliate con una lama di bisturi fresca su Parafilm sotto il cannocchiale da dissezione. Un adattatore per la pipetta a bocca può essere fatto con piccolo tubo Tygon filettato su un ago da siringa collegato a un tubo di bocca. Riempire la punta della pipetta con EGM di nuovo al foro più ampio e prova sul primo lotto di embrioni chitinazed; tagliare la punta della pipetta se è troppo piccolo. La dimensione ideale varierà a seconda dell’età dell’embrione che si sta cercando di ottenere; le fasi molto presto sono più fragili e hanno bisogno di un foro leggermente più grande; embrioni più grandi di otto cellule comprimere con meno danni e spesso uscirà dalle pipette più grandi con l’involucro vitellino intatto. Tali embrioni non permeabilizzati continueranno a svilupparsi fino allo stadio di schiusa.
Utilizzare una siringa sulla pipetta a bocca per riempire e pulire le pipette di permeabilizzazione; la permeabilizzazione effettiva è fatta dalla pressione dell’aria della bocca. Le pipette possono stare all’aria per diverse ore senza seccarsi, dato che il foro è così piccolo, ma asciugandosi finiranno per intasarsi. Conservare le pipette (una buona vale la pena di guardia, e durerà diverse settimane) sciacquando la punta più volte con acqua distillata e sospendendo la punta della pipetta in un tubo di acqua distillata sterile o 0,1 M HCl, utilizzando un nastro “bandiera” sulla pipetta in modo che non affondi completamente.
Se la pipetta è giusta, ci vogliono solo pochi minuti per permeabilizzare un lotto di embrioni aspirandoli singolarmente nella pipetta ed espellendoli delicatamente. Emergeranno più o meno compressi a seconda del diametro interno della pipetta, ma si arrotonderanno di nuovo in pochi minuti. Se c’è molta lisi con la permeabilizzazione, o la digestione era incompleta o il foro della pipetta era troppo piccolo. Come le membrane cellulari sono abbastanza labile per 4-5 min dopo la citochinesi inizia, embrioni devitellinized durante e subito dopo la scissione può sciogliere o blastomeri possono fondere, in seguito subendo una scissione tetrapolare anomala. Se critico, controllare durante un esperimento ed eliminare tali embrioni.
Un ciglio molto sottile (uno strumento tradizionale per la microscopia elettronica) montato su uno stuzzicadenti con colla è lo strumento più soddisfacente per una rapida separazione manuale dei blastomeri; anche un ago di vetro funziona, ma si rompe facilmente. Le ciglia possono essere pulite con alcool e un fazzoletto. I blastomeri si lisciano se separati subito dopo una divisione; 5-10 minuti dopo la scissione è il momento migliore per manipolazioni di successo, a meno che non abbiate bisogno di separazioni precedenti. Le separazioni AB/P1 sono le più facili. Anche gli embrioni a quattro cellule possono essere separati. In alternativa, per ottenere blastomeri P2 e EMS, P1 può essere separato dopo la prima divisione e EMS/P2 dopo la seconda. I blastomeri della linea P possono essere riconosciuti dalle dimensioni relative e dalla loro disposizione lineare. Con una bassa resa, MS, E, P3 e C possono essere separati dai quattro discendenti di un blastomero P1 inizialmente isolato. Le identificazioni delle cellule fatte sulla base delle dimensioni delle cellule possono essere confermate esaminando i periodi distinti del ciclo cellulare.