Indicazioni della PCR 16S rDNA ad ampio spettro
La PCR 16S rDNA ad ampio spettro può rilevare sia batteri vitali che non vitali, come la qPCR. È anche clinicamente utile quando altre tecniche danno risultati negativi, per esempio, nell’endocardite negativa alla coltura, nell’artrite settica, nella meningite o nelle infezioni di lunga durata.8 11 I batteri identificati sono spesso insoliti, rari, difficili da coltivare, o batteri per i quali non è disponibile una PCR specifica.8 9 Gli esempi includono l’identificazione di Helicobacter sp come causa di osteomielite o di Neisseria meningitidis come causa inaspettata di artrite settica mediante PCR 16S rDNA ad ampio spettro, dopo che altre tecniche diagnostiche microbiche avevano dato risultati negativi.12 13 13
È anche possibile fare distinzioni tra specie: Ureaplasma spp consiste di due ceppi batterici, Ureaplasma parvum e Ureaplasma urealyticum, indistinguibili dalla coltura, e ciascuno sospettato di causare una diversa patologia nei neonati.7 14 15 La PCR ad ampio spettro dell’rDNA 16S, seguita dal sequenziamento, ha permesso la differenziazione e l’identificazione di entrambe le specie, aiutando la ricerca sulla patogenicità specie-specifica.8 16
Inoltre, la PCR ad ampio spettro dell’rDNA 16S può identificare batteri precedentemente non caratterizzati. La PCR 16S rDNA ad ampio spettro ha permesso l’identificazione di Bartonella henselae e Tropheryma whippelii come i patogeni alla base della malattia da graffio di gatto e del morbo di Whipple, rispettivamente.17 18
Tuttavia, l’ampiezza della PCR 16S rDNA ad ampio spettro la rende vulnerabile alla contaminazione. Tutto il DNA batterico presente in un campione viene amplificato, compreso quello inevitabilmente presente nei reagenti, il che significa che è impossibile eliminare completamente la contaminazione ambientale di basso livello. Ad un alto numero di cicli termici, questo DNA contaminante di basso livello sarà amplificato e darà un risultato falso positivo. Per ridurre questo rischio, il sequenziamento deve essere effettuato per distinguere tra un patogeno genuino e i contaminanti (spesso batteri di origine idrica altamente improbabili per causare la malattia). Utilizzando le tecniche di sequenziamento standard, solo la sequenza di DNA più dominante può essere identificata, il che significa che nei campioni in cui è presente più di una specie batterica (come le feci) i risultati non sono interpretabili. Questo significa che la PCR 16S rDNA ad ampio spettro con sequenziamento standard non è utile per i campioni provenienti da siti non sterili.
Per ridurre ulteriormente il rischio di essere sopraffatti dalla contaminazione, il numero di cicli termici è ridotto rispetto alle qPCR specifiche, ma questo ha l’effetto concomitante di ridurre la sensibilità.19 Questo significa che la PCR 16S rDNA ad ampio spettro sarà sempre meno sensibile di una qPCR specifica ben progettata nell’ordine di 1-2 log. Un ultimo svantaggio è che questi metodi possono essere limitati a laboratori di ricerca o specializzati, il che significa che i campioni possono aver bisogno di essere spediti via, aumentando il tempo di risposta.16 Un confronto dei principali vantaggi e svantaggi tra i metodi di coltura, la qPCR e la PCR 16S rDNA ad ampio spettro è mostrato nella tabella 1, e un diagramma di flusso delle indagini suggerite per sospette infezioni batteriche del sito sterile che incorporano sia la qPCR che la PCR 16S rDNA ad ampio spettro è visibile nella figura 1C.
In sintesi, la PCR 16S rDNA ad ampio spettro è un’aggiunta cruciale alla diagnostica microbiologica come seconda linea quando l’infezione di un sito sterile è altamente sospetta, ma la coltura e la qPCR per i patogeni più probabili si sono dimostrate negative. A causa del rischio di rilevare la contaminazione del DNA batterico, vengono eseguiti meno cicli di PCR rispetto alla qPCR, con il risultato di un test meno sensibile, quindi la qPCR dovrebbe essere usata per prima (figura 1C). Nella ricerca, la PCR 16S rDNA continuerà ad essere utilizzata per identificare nuove specie batteriche, caratterizzare la patogenicità specie-specifica e come test gold-standard da confrontare quando si valutano nuovi test. Viene anche usato in combinazione con tecniche all’avanguardia, come il sequenziamento di prossima generazione. Questo viene utilizzato per caratterizzare popolazioni microbiche complesse nell’intestino, nelle feci, nella vagina, nella placenta, nei polmoni e in ambienti ambientali.20 Man mano che il sequenziamento di prossima generazione basato sulla PCR 16S rDNA ad ampio spettro diventa più accessibile e ampiamente disponibile, queste tecniche hanno il potenziale di consentire una terapia su misura man mano che la nostra comprensione della complessa interazione tra noi e le nostre comunità microbiche aumenta.21 Per esempio, la PCR 16S rDNA ad ampio spettro delle comunità microbiche intestinali ha identificato cambiamenti distinti in condizioni come l’HIV, il parto pretermine dei neonati e la malnutrizione.22-24 Mentre esploriamo le potenziali vie terapeutiche rivelate in queste diverse condizioni, è probabile che la PCR 16S rDNA ad ampio spettro sarà una pietra miliare di ulteriori ricerche.