Tetramisol (Sigma T1512, 10 mg/ml törzsoldat H2O-ban, kb. 100 μg/ml-re hígítva tojássókban) hozzáadása opcionális; ez a gyógyszer megbénítja a férgeket és megkönnyíti a vágást. Azonnal vágjunk: ha túlságosan összehúzódna, a férgek nem bocsátanának ki sok petét. Minden nap friss szike pengét használjunk, mivel ezek gyorsan korrodálódnak. A felesleges tetramisol csapadék képződését eredményezi a NaOCl-oldatban.

A maximális hozam érdekében több petesejt szabadul fel, ha a levágott férgeket kb. 1 percig kezeljük a közvetlenül a vágási csepphez adott azonos mennyiségű NaOCl-oldattal. Amint a peték felszabadulnak, adjunk hozzá ugyanannyi EGM-et, mint amennyi NaOCl-t használtunk, hogy megakadályozzuk a további peték károsodását. Ez a kezelés elpusztítja a pronukleáris stádiumokat és károsítja az egysejtű embriókat. A 3 perces NaOCl-kezelés még mindig szükséges a kitinázzal történő kezelés előtt az egyenletes emésztés érdekében. A kétsejtes stádiumnál korábbi peték esetében, amelyekben a héj még némileg áteresztő, adjunk hozzá azonos mennyiségű EGM-et, amint a férgeket felvágtuk. Ezután sokan túlélhetik a 3 perces NaOCl- és kitinázkezelést, és néhányan a kitinázkezelés és a vitellinburok eltávolítása után még az egysejtű stádiumban lesznek, ha gyorsan dolgozunk.

A kielégítő transzferpipettákat SMI mikropipettor 5-30μL-es kapillárisokból (Fisher 21-380-9C) vagy World Precision Instruments 4 hüvelykes kapillárisokból (1B100F-4) készíthetjük, nagyon kis láng fölött történő kétszeri húzással. Ez úgy történik, hogy először felmelegítjük és óvatosan meghúzzuk, hogy egy vékony középső szelvényt készítsünk, majd rövid időre lehűtjük, majd óvatosabban újra felmelegítjük, miközben a kapillárist az utolsó húzáshoz feszültség alatt tartjuk. Az ideális húzás során olyan pipettát kapunk, amelynek határozott szárával és keskeny, fokozatosan keskenyedő, kb. 3/4-1 hüvelykes szakaszával rendelkezik. Kis gázégő készíthető egy nagy fecskendőtű parafába szerelésével, a gázáramlás beállításához a csövön csavaros szorítóval. Alternatívaként egyenletes méretű pipetták készíthetők automatizált lehúzógépen történő húzással. Használat előtt törje a kapillárist a kívánt csúcsra, körülbelül 100-150 μm-re (három-négyszeres tojásátmérő) a hüvelykujj körme és ujjbegye közé csippentve, vagy borotvapengével boncmikroszkóp alatt. Egy Microforge mikroszkóp segíthet a konzisztens pipetták készítésében, bár nem szükséges. A folyadék átvitel minimalizálása érdekében tartsa a pipetta átmérőjét kicsire. Ha a peték a pipetta belsejéhez tapadnak, sok közülük a NaOCl-oldattal vagy az EGM-mel történő öblítéssel menet közben visszanyerhető. Számítson arra, hogy gyakran kell pipettát cserélnie, és a munkamenet előtt húzza elő a megfelelő készletet.

Ha a kitinázos emésztés nem működik 8 percen belül, akkor valószínűleg egyáltalán nem fog működni. A leggyakoribb probléma a hipoklorit vagy a férgek fiziológiai állapota (úgy tűnik, hogy az első napi tojásrakás keményebb tojásokat ad). A hipokloritnak le nem járt tételnek kell lennie, és általában a szavatossági idő lejárta előtt kb. egy hónappal válik gyengévé. Tartsa a készletet hűtve, sötét, szellőző üvegben, közel a tetejéig feltöltve. Keverjen össze egy 3 ml-es csövet közvetlenül az indítás előtt, és tartsa jégen; körülbelül 3 óráig működik, és utána ki kell cserélni.

Az enzimes kezelés és különösen a permeabilizálás után az embriók meglehetősen ragadósak, és összecsomósodnak; ez minimalizálható, ha egyszerre csak egyet vagy csak néhányat pipettázunk. A kisebb csomókat úgy lehet felbontani, hogy a pipettából néhányszor kis erővel kilökjük.”

A permeabilizáló pipettákat ugyanúgy kézzel húzzuk, mint a transzferpipettákat, Kwik-fil injekciós kapillárisokkal (1B100F-4 a World Precision Instruments-től). A belső szál segíthet a vitellinburok elvágásában. Az ideális húzás hosszú, fokozatos kúpot ad a vékony szelvényben, így az a kívánt átmérőre vágható. A pipettákat friss szike pengével Parafilmre helyezett szikével vágjuk a bonctávcső alatt. A szájpipettához adaptert készíthetünk kis átmérőjű Tygon csőből, amelyet egy szájpipettára erősített fecskendőtűre kell felhúzni. Töltse meg a pipetta hegyét EGM-mel a szélesebb furatig, és tesztelje a kitinázott embriók első tételén; vágja vissza a pipetta hegyét, ha az túl kicsi. Az ideális méret az embrió korától függően változik; a nagyon korai szakaszok törékenyebbek, és valamivel nagyobb furatot igényelnek; a nyolc sejtnél nagyobb embriók kisebb sérüléssel tömörülnek össze, és gyakran ép vitellinburokkal kerülnek ki a nagyobb pipettákból. Az ilyen nem permeabilizált embriók tovább fejlődnek a kelési stádiumig.

A permeabilizáló pipetták feltöltéséhez és tisztításához használjon fecskendőt a szájpipettán; a tényleges permeabilizálás szájlégnyomással történik. A pipetták több órán keresztül levegőn ülhetnek anélkül, hogy kiszáradnának, mivel a furat olyan kicsi, de ahogy kiszáradnak, végül eltömődnek. Tárolja a pipettákat (egy jó pipettára érdemes vigyázni, és több hétig is kitart) úgy, hogy a pipetta hegyét többször átöblíti desztillált vízzel, és a pipetta hegyét egy steril desztillált vizet vagy 0,1 M HCl-t tartalmazó csőbe függeszti, a pipettára szalagos “zászlót” helyezve, hogy ne süllyedjen el teljesen.

Ha a pipetta megfelelő, csak néhány percig tart egy adag embrió permeabilizálása, amikor egyenként beszívja őket a pipettába és óvatosan kilöki. A pipetta belső átmérőjétől függően jobban vagy kevésbé összenyomódva fognak kijönni, de néhány percen belül újra lekerekülnek. Ha a permeabilizálással sok lízis keletkezik, akkor vagy az emésztés nem volt teljes, vagy a pipetta furata túl kicsi volt. Mivel a sejtmembránok a citokinézis megkezdése után 4-5 percig meglehetősen labilisak, a hasadás során és közvetlenül a hasadás után devitellinizált embriók lízisbe kerülhetnek, vagy a blasztomerek összeolvadhatnak, és később abnormális tetrapoláris hasadáson mehetnek keresztül. Ha kritikus, a kísérlet során ellenőrizzük, és az ilyen embriókat elimináljuk.

A fogpiszkálóra ragasztóval rögzített nagyon finom szempilla (hagyományos elektronmikroszkópos eszköz) a legmegfelelőbb eszköz a gyors manuális blasztoméraválasztáshoz; az üvegtű is működik, de könnyen eltörik. A szempillákat alkohollal és egy zsebkendővel lehet megtisztítani. A blastomerek lúgosodnak, ha közvetlenül az osztódás után választjuk szét őket; a hasadás után 5-10 perc a legjobb időpont a sikeres manipulációkhoz, hacsak nincs szükség korábbi elválasztásokra. Az AB/P1 elválasztások a legegyszerűbbek. Négysejtű embriók is szétválaszthatók. Alternatív megoldásként a P2 és EMS blasztomerek előállításához a P1 az első osztódás után, az EMS/P2 pedig a második osztódás után szeparálható. A P-vonalbeli blastomereket a relatív méretük és lineáris elrendezésük alapján lehet felismerni. Alacsony hozammal az MS, E, P3 és C elválasztható a kezdeti izolált P1 blastomer négy leszármazottjából. A sejtméret alapján végzett sejtazonosítások megerősíthetők a különböző sejtciklus-periódusok vizsgálatával.

Articles

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.