A széles hatótávolságú 16S rDNS PCR indikációi
A széles hatótávolságú 16S rDNS PCR a qPCR-hez hasonlóan életképes és nem életképes baktériumokat is képes kimutatni. Klinikai szempontból akkor is hasznos, ha más technikák negatív eredményt adnak, például tenyésztés-negatív endokarditisz, szeptikus artritisz, meningitisz vagy hosszú távú fertőzések esetén.8 11 Az azonosított baktériumok gyakran szokatlanok, ritkák, nehezen tenyészthetőek, vagy olyan baktériumok, amelyekre nem áll rendelkezésre specifikus PCR.8 9 Példaként említhető a Helicobacter sp azonosítása a csontvelőgyulladás vagy a Neisseria meningitidis azonosítása a szeptikus artritisz váratlan okaként széles körű 16S rDNS PCR segítségével, miután más mikrobiális diagnosztikai technikák negatív eredményt adtak.12 13 13
A fajok közötti különbségtétel is lehetséges: Az Ureaplasma spp két baktériumtörzsből, az Ureaplasma parvumból és az Ureaplasma urealyticumból áll, amelyek tenyésztéssel nem különböztethetők meg, és mindkettő a gyanú szerint különböző patológiát okoz újszülöttekben.7 14 15 A széles hatótávolságú 16S rDNS PCR, majd a szekvenálás lehetővé tette mindkét faj megkülönböztetését és azonosítását, segítve a fajspecifikus patogenitás kutatását.8 16
A széles hatótávolságú 16S rDNS PCR emellett korábban nem jellemzett baktériumokat is azonosíthat. A széles hatótávolságú 16S rDNS PCR lehetővé tette a Bartonella henselae és a Tropheryma whippelii azonosítását, mint a macskakarmolásos betegség, illetve a Whipple-kór hátterében álló kórokozókat.17 18 18
A széles hatótávolságú 16S rDNS PCR azonban a széles hatótávolságú 16S rDNS PCR-t sebezhetővé teszi a szennyeződésekkel szemben. A mintában lévő összes bakteriális DNS felerősítésre kerül, beleértve a reagensekben elkerülhetetlenül jelenlévő DNS-t is, ami azt jelenti, hogy az alacsony szintű környezeti szennyeződést lehetetlen teljesen kiküszöbölni. Nagyszámú hőciklus esetén ez az alacsony szintű háttérszennyező DNS felerősödik, és hamis pozitív eredményt ad. E kockázat csökkentése érdekében a szekvenálást úgy kell elvégezni, hogy különbséget lehessen tenni a valódi kórokozó és a szennyező anyagok (gyakran vízben élő baktériumok, amelyek nagy valószínűséggel nem okoznak betegséget) között. A standard szekvenálási technikák alkalmazásával csak a legdominánsabb DNS-szekvencia azonosítható, ami azt jelenti, hogy olyan mintákban, ahol egynél több baktériumfaj van jelen (például széklet), az eredmények nem értelmezhetőek. Ez azt jelenti, hogy a széles spektrumú 16S rDNS PCR standard szekvenálással nem hasznos a nem steril helyekről származó minták esetében.
A szennyeződés okozta túlterhelés kockázatának további csökkentése érdekében a termikus ciklusok számát a specifikus qPCR-ekhez képest csökkentik, de ez egyidejűleg az érzékenység csökkenésével jár.19 Ez azt jelenti, hogy a széles spektrumú 16S rDNS PCR mindig 1-2 log nagyságrenddel kisebb érzékenységű lesz, mint egy jól megtervezett specifikus qPCR. Egy utolsó hátrány, hogy ezek a módszerek kutatási vagy speciális laboratóriumokra korlátozódhatnak, ami azt jelenti, hogy a mintákat esetleg el kell küldeni, ami megnöveli az átfutási időt.16 A tenyésztési módszerek, a qPCR és a széles spektrumú 16S rDNS PCR közötti legfontosabb előnyök és hátrányok összehasonlítása az 1. táblázatban látható, a bakteriális steril fertőzések gyanúja esetén javasolt vizsgálatok folyamatábrája pedig a qPCR-t és a széles spektrumú 16S rDNS PCR-t is magában foglaló 1C. ábrán látható.
Összefoglalva, a széles hatótávolságú 16S rDNS PCR a mikrobiológiai diagnosztika fontos kiegészítője, mint második vonal, amikor egy steril hely fertőzése erősen gyanús, de a tenyésztés és a qPCR a legvalószínűbb kórokozók esetében negatívnak bizonyult. A bakteriális DNS-szennyeződés kimutatásának kockázata miatt kevesebb PCR-ciklust kell elvégezni, mint a qPCR esetében, ami kevésbé érzékeny vizsgálatot eredményez, ezért a qPCR-t kell először alkalmazni (1C. ábra). A kutatásban a 16S rDNS PCR-t továbbra is használni fogják az új baktériumfajok azonosítására, a fajspecifikus patogenitás jellemzésére, valamint az új próbák értékelésénél összehasonlításra szolgáló arany standard próbaként. Ezt a legmodernebb technikákkal, például az újgenerációs szekvenálással kombinálva is alkalmazzák. Ezt a bélben, székletben, hüvelyben, méhlepényben, tüdőben és környezeti környezetben található összetett mikrobapopulációk jellemzésére használják.20 Ahogy a széles körű 16S rDNS PCR-en alapuló következő generációs szekvenálás egyre megfizethetőbbé és széles körben elérhetővé válik, ezek a technikák lehetővé tehetik a személyre szabott terápiát, mivel egyre jobban megértjük a köztünk és mikrobiális közösségeink közötti összetett kölcsönhatást.21 Például a mikrobiális bélközösségek széles hatótávolságú 16S rDNS PCR-je olyan állapotokban azonosított határozott változásokat, mint a HIV, a koraszülés utáni újszülöttek és az alultápláltság.22-24 Ahogy feltárjuk az e különböző állapotokban feltárt lehetséges terápiás utakat, valószínű, hogy a széles hatótávolságú 16S rDNS PCR a további kutatások sarokköve lesz.