Drosophila lines
Sever lines (GMR57C10-Gal4, elav-Gal4, UAS-GCaMP6s, UAS-GCaMP6f, UAS-CD4:tdGFP és UAS-tdTomato) a Bloomington Stock Centerből származnak. A MAN-Gal4 (VT50660-AD; VT14014-DBD) és az MDN-1-Gal4 (VT44845-DBD; VT50660-AD) B. Dickson (Janelia Research Campus) biztosította. DNa01-Gal4 (SS00731: GMR22C05-AD; GMR56G08-DBD), DNb06-Gal4 (SS02631: GMR20C04-AD; BJD113E03-DBD), DNg13-Gal4 (SS02538: BJD118A10-AD; BJD123E03-DBD) és DNg16-Gal4 (SS01543: BJD104A07-AD; BJD107F12-DBD) a G. Rubin (Janelia Research Campus).
Act88F:Rpr konstrukció és legyek generálása
Actin88F:Rpr törzseket (Act88F:Rpr legyek) Actin88F:eGFP konstrukcióval29 hoztuk létre. Az Act88F:GFP vonalat, amely az actin88F promóter 2053 bp-os régiója által vezérelt eGFP konstrukciót tartalmazza, R. Bentontól (Lausanne-i Egyetem) kaptuk. Az Act88F:Rpr konstrukciót úgy hoztuk létre, hogy először a következő primerpárt használtuk, hogy egy rpr cDNS-klón (IP02530, Drosophila Genomics Resource Center, Bloomington, IN) 5′ végéhez egy KpnI restrikciós helyet, a nyitott olvasási keret 3′ végéhez pedig egy XbaI helyet adjunk a QuikChange Site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies) segítségével:
Forward primer 5′ AGACGGTACCATGGCAGTGGCATTC 3′
Reverse primer 5′ GCCGCGTCTAGATCATTGCGATGATGGCTT 3′
Az Rpr konstrukciót ezután az Act88F-be spliceltük:eGFP konstrukcióba az Act88F promóter mögé az eGFP szekvencia helyére. Az Act88F:Rpr konstrukciót attp18 Drosophila embriókba injektáltuk a PhiC31 integráz által közvetített helyspecifikus transzgenezishez35 (transzgén leszállóhely 6C12 citolokáció) a BestGene Inc. által. (Chino Hills, CA). Egyes kísérletekhez ezt a transzgént UAS-GCaMP6s-p2A-tdTomatóval kombináltuk (M.H.D. laboratóriumában előállított).
A közvetett repülési izmok fluoreszcens képalkotása
Fluoreszcens mikroszkópiát végeztünk a hemi-torákról36,37. Röviden, a legyeket elaltattuk, majd eltávolítottuk a fejüket és a hasukat. A mellhártyákat egy éjszakán át 4%-os paraformaldehidben fixáltuk 4 °C-on, majd másnap 1× foszfát pufferelt sóoldatban (PBS) öblítettük. A példányokat üveglemezre helyeztük, folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, majd borotvapengével a középső síkban kettévágtuk. Az IFM-eket Alexa-Fluor 568 Phalloidinnal (1:100 arányban PBS-ben 0,1% Triton-X-szel (PBST)) festettük egy éjszakán át 4 °C-on, majd PBS-szel öblítettük és az EVOS® FL Cell Imaging System (Life Technologies) segítségével ×4-es nagyításban vizualizáltuk. Az IFM myofibrillumok egészben történő leképezéséhez a legyeket a fent leírtak szerint preparáltuk és félbevágtuk a mellkasokat. A hemi-toracokat Alexa-Fluor 568 Phalloidinnal (1:100 PBST-ben) festettük meg egy éjszakán át 4 °C-on. A mintákat PBS-ben öblítettük, Vectashielddel (Vector Laboratories) rögzítettük és Leica TCS SPE RGBV konfokális mikroszkóppal (Leica Microsystems) 100x nagyításban vizualizáltuk.
Agyak és ventrális idegszálak immunfluoreszcens képalkotása
Agyakat és VNC-ket 2-3 dpe nőstény legyekből PBS-ben boncoltuk ki. A szöveteket ezután 20 percig szobahőmérsékleten 4%-os paraformaldehidben PBS-ben fixáltuk. A fixálás után az agyakat és a VNC-ket 2-3 alkalommal, egyenként 10 percig mostuk 1%-os Triton-X-100-at tartalmazó PBS-ben (PBST), majd egy éjszakán át 4 °C-on PBST-ben inkubáltuk. Ezután a mintákat 5%-os normál kecskeszérumot tartalmazó PBST-be (PBSTS) helyeztük 20 percre szobahőmérsékleten. Ezután elsődleges antitestekkel (nyúl anti-GFP 1:500, Thermofisher RRID: AB_2536526; egér anti-Bruchpilot/nc82 1:20, Developmental Studies Hybridoma Bank RRID: AB_2314866) inkubáltuk őket 48 órán keresztül 4 °C-on, PBSTS-ben hígítva. Az agyakat és a VNC-ket 2-3 alkalommal, egyenként 10 percig öblítettük PBST-ben, mielőtt másodlagos antitestekkel (kecske antinyúl másodlagos antitest, konjugálva Alexa 488-al 1:500-ban; Thermofisher; kecske antiegér másodlagos antitest, konjugálva Alexa 633-al 1:500-ban; Thermofisher) inkubáltuk PBSTS-ben 48 órán keresztül 4 °C-on. Végül az agyakat és a VNC-ket 2-3 alkalommal, egyenként 10 percig öblítettük PBST-ben, majd Slowfade montírozó médiában (Thermofisher) híd fedőlapokkal ellátott tárgylemezekre montíroztuk.
A mintákat Carl Zeiss LSM 700 lézerpásztázó konfokális mikroszkóppal képeztük le a következő beállításokkal: ×20 nagyítás, 8 bites dinamikatartomány, 2× képátlagolás, 0,52 × 0,52 μm pixelméret, 0,57 μm z-lépésköz. A képalkotó térfogatok z-projekcióit a Fiji38 segítségével készítettük el. A központi idegrendszeri GFP-expresszió összehasonlítása érdekében a lézer intenzitását és a zöld csatorna PMT-erősítését a vad típusú, az A1 > GFP és az Act88F:GFP mintákban állandó értéken tartottuk.
A GFP-expresszió leképezése a lábizmokban
A lábakat kézzel boncoltuk a test-koxa ízületnél, és kétoldalas ragasztószalaggal üveglemezekre rögzítettük. Ezután a fedőlemez és a tárgylemez közötti térbe Slowfade montírozó médiát (Thermofisher) adtunk. Ezután a GFP fluoreszcenciáját a zöld csatornában rögzítettük egy LSM 700 lézeres pásztázó konfokális mikroszkóp (Zeiss) segítségével. A lézerintenzitást, a PMT erősítést és a pásztázási paramétereket a vad típusú, az MHC > GFP és az Act88F:GFP állatok esetében állandó értéken tartottuk: ×20-as nagyítás, 8 bites dinamikatartomány, ×8-as képátlagolás, 0,63 × 0,63 µm-es pixelméret és 10 µm-es z-lépésköz. A kutikuláris autofluoreszcenciát a vörös csatornában is rögzítettük.
Torakális boncolás a VNC képalkotáshoz
A képalkotás során a legyek rögzítéséhez használt egyedi tartók a korábban leírtak szerint készültek39. A VNC-képalkotáshoz ezeket az állványokat úgy módosítottuk, hogy (i) lapos, nem pedig hajtogatott acél alátétek legyenek, és (ii) ferdített csúcsok, hogy a gömb alakú futószalag látható legyen az optikai áramlásérzékelők számára (Shapeways, “file”). Az acél alátétek 0,001″ rozsdamentes acélból készültek, 316-os típusú, lágy lágyított acélból (McMaster-Carr, alkatrész #2317K11). Az alátéteket marattuk (Etchit, Buffalo, MN), hogy téglalap alakú lyukakat hozzunk létre az itt leírtak szerint. A shim tervezési fájl “itt” található.
Minden kísérletet 1-3 dpe nőstény legyeken végeztünk, amelyeket 25 °C-on, standard kukoricalisztes táplálékon, 12 órás világos:12 órás sötét ciklusban neveltünk. A legyeket 4 °C-on altattuk. Kiválasztottunk egy nőstény legyet, és néhány esetben a szárnyait levágtuk a rögzítési folyamat egyszerűsítése érdekében. Ezután a légy hátulsó mellkasát átnyomtuk a képalkotó állvány acéllemezén lévő lyukon. Ezután az állványt megfordítottuk, UV-keményedő ragasztót (Bondic, Aurora, ON Canada) vittünk fel óvatosan a mellkas köré, majd UV-megvilágítással (LED-200, Electro-Lite Co. Bethel, CT USA) megszilárdítottuk. Ezután UV-ragasztóval rögzítettük a fejet és a hasat a színpad aljára. Az állványt ezután extracelluláris sóoldattal töltöttük fel18. Nagy nagy nagyítású boncmikroszkóp (Leica M165C) alatt egy injekciós tűvel (30 G, BD PrecisionGlide, Franklin Lakes, NJ USA) felszeleteltük és leemeltük a kutikulát a háti mellkasról40 , ügyelve arra, hogy ne vágjuk el a nyaki kötőszövetet. Ezt követően a nem Act88F:Rpr állatoknál egy tompa csipesszel eltávolítottuk az IFM-eket, főként a mellkas elülső-mediális régiójából, a bél felett (ez a lépés szükségtelen az Act88F:Rpr állatoknál). Ez a folyamat feltárja a proventriculus – egy nagy, gömbölyded bélszerkezet – dorzális felszínét. Ezután nagy óvatossággal egy pár szuperfinom csipesszel megfogtuk és megemeltük a proventriculust, hogy a bél nagy részét (beleértve a termést és a nyálmirigyeket) eltávolítsuk a ventrálisan elhelyezkedő idegszövetektől. Az így megemelt bélzetet ultrafinom ollóval (Fine Science Tools, Foster City, CA USA) vágtuk át a legelülső részén. Ezután a proventriculust visszahúztuk, és egy hátsó bemetszést e bélszakaszok teljes eltávolításához végeztünk, felfedve az alatta lévő idegszövetet. Figyelemre méltó, hogy ez a metszés az aortát is eltávolítja, korlátozva a hemolimfa áramlását a hasi háti érből. Ennek ellenére úgy találtuk, hogy a legyek életképesek voltak és 4 órán keresztül viselkedtek. Néhány esetben megfigyeltük, hogy a bél- vagy izomszövet elkezdte eltakarni a VNC-t a képalkotás során. Ezért a laza szöveteket ebben a szakaszban el kell távolítani, miközben nagy gondot fordítunk arra, hogy a VNC-t ne vágjuk el. Minden egyes boncolás után megvizsgáltuk, hogy az állat mennyire mozgatta a lábait egy légfújás hatására, vagy mennyire ragadott meg egy tárgyat az egyes lábaival. Ez a preparálás sikerének pontos előrejelzőjének bizonyult. A boncolás minőségének értékeléséhez megvizsgáltuk az egyes lábak mozgását a gömb alakú futópadon. Ha a légy képes volt koordináltan járni, a boncolást sikeresnek tekintettük. Ellenkező esetben az állatot úgy minősítettük, hogy a végtagok mozgása hiányos volt. Azokat az állatokat, amelyeknek több lábuk is diszfunkcionált, cselekvésképtelennek minősítettük.
2-foton mikroszkópia viselkedés közben
A kísérleteket az esti Zeitgeber-időben (Z.T.) végeztük, és az állatokat jellemzően 30-60 perccel a boncolás után képeztük le. A légytartókat egy megemelt platformra rögzítették a gömb alakú futópad fölé (3a. kiegészítő ábra). A VNC-t ezután mikroszkópos okulárokkal lokalizáltuk, és 2-fotonos képalkotással a látómező közepére pozícionáltuk.
A gömbi futópad egy alumínium rúd, amelynek egyik végére gömb alakú lyukat marattunk22. 10 mm átmérőjű habgolyókat gyártottunk (Last-A-Foam FR-7106, General Plastics, Burlington Way, WA USA), és kézzel, Rapidograph tollal (Koh-I-Noor, Leeds, MA USA) pöttyöztük őket, hogy nagy kontrasztú vonásokat biztosítsunk az optikai áramlásmérésekhez. Digitális áramlásszabályozó (Sierra Instruments, Monterey, CA USA) segítségével 500-600 ml min-1 szűrt és párásított levegő áramlását vezettük át a tartón. A golyó mozgását két optikai áramlásérzékelővel (ADNS3080) mértük, amelyek zoomlencsékkel (Computar MLM3X-MP, Cary, NC USA) voltak felszerelve. A labda és a légy megvilágítása optikai szálakhoz és kollimátorlencsékhez (ThorLabs, Newton, NJ USA) csatlakoztatott IR LED-ek (850 nm csúcs hullámhossz) segítségével történt. Az optikai áramlás méréseit egy mikrokontroller lapra (Arduino Mega2560) továbbítottuk, hogy egyedi Python kód segítségével rögzítsük. Ezzel egyidejűleg egy IR-érzékeny firewire kamerával (Basler, Ahrensburg, Németország) körülbelül 30 fps sebességgel videófelvételeket készítettünk a labdán viselkedő állatokról.
2-foton mikroszkópiát végeztünk egy Bergamo II mikroszkóp (ThorLabs) segítségével, amelyet két GaAsP PMT detektorral szereltünk fel a GCaMP6 és tdTomato képalkotáshoz, és egy 930 nm-re hangolt Ti:Sapphire lézerhez (MaiTai DeepSee, Newport Spectra-Physics, Santa Clara, CA USA) kapcsoltunk. Egy Olympus 20×-os vízmélyítésű, 1,0 NA-jú objektívet használtunk (Olympus, Center Valley, PA USA). A mikroszkópot a ThorImage szoftverrel (ThorLabs) vezéreltük. A koronális metszeti képalkotási kísérleteket Galvo-Galvo képalkotási módban végeztük 6-9 Hz-en. Ez a képkockasebesség a képméret függvényében változott, amely 26,58 × 26,58 µm és 53,15 × 53,15 µm között mozgott. A lézer teljesítménye 3 mW és 5,7 mW között mozgott. Megfelelő hardverrel (pl. Galvo-Resonancia szkenner és Piezo meghajtású objektívgallér) volumetrikus képalkotás is lehetséges.
A járási viselkedés kiváltására alkalmanként egy levegőfújást használtak. Ezeket a fújásokat digitálisan kódolták (Honeywell AWM 3300 V, Morris Plains, NJ USA). Egyedi ROS-szoftver, amely egy analóg kimeneti eszközön (Phidgets, Calgary, Kanada) keresztül kapcsolódott a ThorSync szoftverhez (ThorLabs), az optikai áramlásmérések, a viselkedési videográfia, a légpuff mérések és a 2-foton képgyűjtés szinkronizálására szolgált. A koronális metszet képalkotásához egy Piezo gallért (Physik Instrumente, Karlsruhe, Németország) használtunk a mikroszkóp objektívlencse gyors z-tengelyű mozgásának vezérlésére.
A kontroll és az Act88F:Rpr állatok közötti idegi aktivitás összehasonlításához 512 × 512 pixeles képeket készítettünk 1,7 fps sebességgel, állandó lézerintenzitás és PMT erősítés alkalmazásával. A kiválasztott képalkotó régiókat empirikusan választottuk ki, mint az 1. kiegészítő filmben ~61-65 µm mélységben megfigyelt tájékozódási pontokból álló vízszintes metszeteket.
A járás összehasonlítása boncolással vagy anélkül
A boncolás mozgásra gyakorolt hatásának értékeléséhez a vad típusú állatokat a következő eljárásnak vetettük alá. Az állatokat képalkotó állványokra szereltük, és minden állványhoz sóoldatot adtunk. Az állatoknak csak egy véletlenszerű részhalmazát boncoltuk. Ezután minden egyes szerelt legyet a gömb alakú futópadra helyeztünk, és 30 percen keresztül rögzítettük a járási viselkedésüket. Az optikai áramlást a fent leírtak szerint rögzítettük. A lokomóció valószínűségének növelése érdekében a légy antennáira egy 500 ms-os, 100%-os CO2-ból álló impulzust irányítottunk egy perces impulzus-intervallummal (0,05 ln min-1 tömegáram-szabályozóval; Vögtlin Instruments, Svájc).
Infravörös lézeres antennastimuláció
Az Act88F:Rpr és a kontroll állatok járási viselkedésének összehasonlításához az antennáikat 830 nm-es közeli infravörös lézerrel (Schäfter + Kirchhoff, Németország) stimuláltuk. Először 4 °C-on elaltattuk a 7-8 dpe nőstény állatokat, és képalkotó állványokra szereltük őket. A legyeket ezután 10 percig akklimatizáltuk. Minden kísérletben egy állat tíz 2 s-os lézeres stimulációs impulzust (18,1 mW) kapott a jobb antennájára, 60 s impulzus-intervallummal. A kontroll és az Act88F:Rpr állatokat felváltva vizsgáltuk, hogy minimalizáljuk a cirkadián idő hatását a viselkedési összehasonlításokra.
Statisztika
Az állatkísérletek mintavételi méretét a következőképpen választottuk meg: legalább három kísérletet végeztünk a populációs és ritka neurális felvételek illusztrálására, és csoportonként több mint tíz kísérletet végeztünk, amikor statisztikai összehasonlításokat végeztünk. Az alacsony jel-zaj fluoreszcenciajelek előre meghatározott kritériuma két MDN-kísérlet eltávolítását eredményezte az adatállományunkból. Nem alkalmaztunk randomizálást vagy elvakítást. Az antennalézer-stimuláció esetében az adatok nem voltak normális eloszlásúak, ezért Friedman- és Mann-Whitney U-teszteket végeztünk. A szórás becslését átlagértékként és bootstrapped 95%-os konfidenciaintervallumként mutatjuk be.
Adatelemzés
Az összes adatot egyedi Python szkriptek segítségével elemeztük. Mivel az adatgyűjtési frekvencia különbözött az optikai áramlás, a viselkedési videográfia és a 2-foton képalkotás esetében, interpoláltuk a jeleket, hogy megfeleljenek a legmagasabb frekvenciájú jeleknek. Ezt követően az optikai áramlási adatokat egy futó átlag (ablak = 200 ms) segítségével simítottuk, majd az elülső-hátsó, medialis-laterális és yaw tengelyek s-1 fordulataira fordítottuk22. Annak érdekében, hogy ezek a mérések intuitívabbá váljanak, a rotációk s-1 értékét az elülső-hátsó (vforward) és medial-laterális (vside) mozgások esetében mm s-1-re (1 rot s-1 = 31,42 mm s-1), a yaw (vrotation) mozgások esetében pedig fok s-1-re (1 rot s-1 = 360° s-1) alakítottuk át22.
A boncolt állatok mozgásának elemzése (2. kiegészítő ábra) a következőképpen történt. A 20 felboncolt és 20 nem felboncolt légy Vforward optikai áramlási adatait 1500 pontra s-1 lemintavételeztük, és 0,2 s időtartamú futó átlaggal simítottuk. Az előre/hátra, illetve oldalra járás százalékos arányának kiszámításához empirikusan két küszöbértéket, -0,31 mm s-1 és +0,31 mm s-1 -et határoztunk meg, hogy megkülönböztessük a mozdulatlanságot és az előre (jobbra), illetve hátra (balra) járást. A 0,31 mm s-1 feletti értékeket az előre (jobbra) járás pillanatainak, a -0,31 mm s-1 alatti értékeket pedig a hátra (balra) járás pillanatainak tekintettük. Az e küszöbértékek közötti optikai áramlási értékeket a mozdulatlanság pillanatainak tekintettük. A gyaloglási idő százalékos arányát azon adatpontok arányaként számoltuk ki, amelyekben az állatot nem tekintettük mozdulatlannak. Hasonlóképpen a 10,8 és -10,8 s-1 fokos küszöbértékeket használtuk a megfordulás pillanatainak meghatározására. Egy menetet a járás vagy a forgás folyamatos időszakaként definiáltunk.
A viselkedés során nagy szöveti deformációk fordulhatnak elő. Ezért post-hoc pán-neuronális képregisztrációt végeztünk (2. ábra). Egy képalkotó kísérlet összes képkockáját egy referenciaképre regisztráltuk. Mivel a deformációk összetettségét nem lehetett egyszerű parametrikus mozgásmodellekkel (pl. affin transzformációk) megragadni, nem parametrikus, variációs megközelítést alkalmaztunk, amelyet tetszőlegesen összetett deformációk modellezésére terveztünk. A w mozgásmezőt az Ir jelű referenciakép és az It jelű t időpontú kép között úgy számoltuk ki, hogy megoldottuk a minimalizálási problémát
ahol D(w) egy adatillesztő kifejezés, a második kifejezés egy olyan regularizáció, amely a w simaságát segíti elő a gradiens ∇w41 büntetésével, Ω a diszkrét képtartomány, és a λ paraméter kiegyensúlyozza a két kifejezés hozzájárulását.
GCaMP6s képek kihívást jelentenek a mozgásbecsléshez, mivel az idegi aktivitás nagy helyi intenzitásváltozásokat okoz. Ezért egy további, aktivitástól független fluorofort, a tdTomato-t használtuk, és egy
Az első kifejezés az egyes pixelek pályája mentén az intenzitás megőrzésének standard feltételezését modellezi. Ezt a következőképpen határozzuk meg:
ahol egy \(\ell _1\) normát használunk, hogy részleges robusztusságot nyerjünk az intenzitásváltozásokkal szemben42. A (2) egyenlet második tagja egy Revaud és munkatársai43 által inspirált jellemzőillesztési kényszer, amelyet a következőképpen írunk fel:
A (2)-(4) egyenletekben Ir és It a tdTomato csatornából származik. A ϕ függvény minimalizálása előnyben részesíti, hogy a w(x) mozgásvektorok közel legyenek a releváns kulcspontok ritka halmazán kiszámított m(x, Ir, It) jellemző megfeleltetésekhez. Az m-t a Revaud és munkatársai43 által javasolt jellemzőillesztési algoritmussal kapjuk meg, amelyet kifejezetten a nagy képdeformációk kezelésére terveztek. Az m-t a tdTomato képalkotó csatorna segítségével számoljuk ki, így a megfeleltetések az Ir és It közötti intenzitásváltozásokra is érzéketlenek. Ennek eredményeképpen a becslést megbízható jellemzőillesztések irányítják. A γ paraméter kiegyensúlyozza a (2) egyenlet két tagját.
Minden kísérlethez optimalizáltuk a λ és γ értékeit a VNC vízszintes metszeti képeit regisztráló rácsos keresés segítségével (4. kiegészítő ábra). Az optimalizálás célfüggvényeként az időbeli középkép gradiensét44 használtuk. A λ kis értékei (azaz λ < 1000) alkalmanként leleteket eredményeztek a regisztrált képeken. Ezek a leletek a w(x) vektormező erős konvergenciájához kapcsolódtak (4c. kiegészítő ábra). Ezért empirikusan úgy definiáltuk a leleteket, mint olyan pixelcsoportokat, amelyek \({\mathrm{div}}\,{\mathbf{w}}\left( {\mathbf{x}} \right) < – 1.2\) és kardinalitása >20 (hasonló eredményeket kaptunk >5 kardinalitással is). Végül a λ és γ értékeket úgy választottuk ki, mint amelyeknél nincsenek artefaktumok és a legnagyobb gradiens az átlagos képen. A három optimalizált példa nem regisztrált mintaképei, transzformációs vektormezői és regisztrált képei az 5. kiegészítő filmben láthatók.
Az (1) egyenletben szereplő optimalizálási problémát az ADMM (alternated direction method of multiplier) algoritmussal45 oldottuk meg. Két osztóváltozót vezettünk be, amelyek a regularizációs, illetve a jellemzőillesztési feltételekhez kapcsolódnak. Az algoritmus minden egyes részproblémáját analitikusan oldottuk meg. Az inverz problémakönyvtár egyes részeit használtuk, amelyeket a ref. 46. A súlyozott mediánszűrésen alapuló utófeldolgozást alkalmaztuk a47. cikkből származó módszerrel.
A 2. ábrán a viselkedéseket félautomatikusan jegyzeteltük, egy egyedi Python-modul segítségével. Ez a modul lehetővé teszi a felhasználó számára, hogy a videó első képkockáján két érdekes régiót (ROI) válasszon ki. Az első ROI-t a járás észlelésére használják, és a metathoracalis és mezothoracalis lábak fölé kell pozícionálni. A második ROI a prothoracalis lábak ápolásának érzékeléséért felelős, és a légy előtt kell elhelyezni. A mozgás érzékeléséhez ezekben a régiókban az egymást követő képkockákat kivonjuk. Az így kapott differenciális képeket ezután medián homályosítjuk (sugár = 5 pixel) a zaj csökkentése érdekében. E homályosított kép alapján a két ROI-ban a nem nullás pixelek számának küszöbértékét alkalmazzuk, hogy kivonjuk az ápolás és a járás bináris szekvenciáit. Megjegyzendő, hogy a járás során megfigyelt prothoracalis lábmozgásokat figyelmen kívül hagyjuk (azaz a gondozás osztályozása a járás osztályozásának van alárendelve). Ezután hiszterézisszűrőt alkalmaztunk a bináris viselkedési szekvenciák aluláteresztő szűrésére és azon átmenetek eltávolítására, amelyek túl kevés képkockán keresztül történnek ahhoz, hogy biológiailag hihetőek legyenek. Példa ROI-k és viselkedési megjegyzések a 6. kiegészítő filmben láthatók. Ezeket a viselkedési adatokat a 2. ábrán a 2. kiegészítő filmben bemutatott módon használtuk fel. A következő paraméterek használatával annotáltuk: küszöbérték a járáshoz = 400, küszöbérték az ápoláshoz = 5, hiszterézishossz a járáshoz = 8, hiszterézishossz az ápoláshoz = 10.
A 2b, c ábrák esetében lineáris regressziót használtunk, hogy megtaláljuk a VNC-ben a járáshoz vagy az ápoláshoz kapcsolódó régiókat. Az Xw és Xg regresszorokat (a járáshoz, illetve az ápoláshoz) a két viselkedési szekvenciából, Sw és Sg, az (5) egyenlet segítségével konvolúcióval konstruáltuk a GCaMP6s (t½ = 1,1448 s)19 mért időállandóból származtatott exponenciálisan csökkenő kalciumjel impulzusválasz (CIR) segítségével.
A célfüggvények pixelenkénti ∆F/F nyomvonalak voltak, ahol ∆F = Ft – F. Ft a fluoreszcencia a t időpontban. F egy alapszintű fluoreszcenciajel, amelyet az első tíz egymást követő GCaMP6s kép pixelértékének átlagaként mértek, amelyeken nem volt megfigyelhető sejtaktivitás (azaz, minimális és változatlan GCaMP6s fluoreszcencia).
A regressziós súlyokat a (6) egyenlet segítségével számoltuk ki.
ahol y a pixelenkénti ∆F/F nyomvonal.
A 2b, c ábrán a regresszor súlyok, ww a járásra és wg az ápolásra, hőtérképeit láthatjuk, a megfelelő maximumokra normalizálva. Az 1. ROI-t választottuk ki a hőtérkép azon régiójának, ahol az ápolásnak magas, de a járásnak alacsony a súlya. A 2. ROI-t választottuk a ww legmagasabb értékével rendelkező térbeli helynek. Minden ROI egy 15 pixel sugarú régiót ölel fel.
A ritka neurális képalkotási adatok (3-5. ábra) feldolgozásának azonosításához a ROI-kat először az OpenCV és a Numpy könyvtáraktól függő egyedi Python szkriptek segítségével választottuk ki. Ehhez kiválasztottunk egy referenciakeretet, amelyre a szoftver az összes potenciális ROI-t azonosította. Ehhez a GCaMP6s képet kisimították a háttérzaj csökkentése érdekében, majd egy Otsu szűrő küszöbértékét alkalmazták a képre. Ezután egy eróziós tényezőt alkalmaztak a képen észlelt összes objektumra. Ezután az összes észlelt objektum kontúrjait a felhasználó elé tártuk kézi kiválasztás céljából. Miután ezeket a referencia ROI-kat kiválasztottuk a bal és jobb neuronokhoz, egy keresztkorreláció-alapú képregisztrációs algoritmust48 használtunk, hogy a referenciaképen manuálisan kiválasztott ROI-k alapján azonosítsuk a legvalószínűbb bal és jobb ROI-kat minden egyes képkockához. Egy második szkriptet használtunk az automatikusan kiválasztott ROI-k kézi ellenőrzésére, és ha hibásak voltak, a képkockán belül az összes lehetséges ROI-t megjelenítettük kézi kiválasztás céljából. Ha az eróziós értékek hibás ROI-kat eredményeztek, egy másik szkriptet használtunk arra, hogy manuálisan pozícionáljuk a tetszőleges orientációjú elliptikus ROI-kat az adott képkockán. Végül a bináris ROI-képeket képmaszkként használtuk az eredeti GCaMP6s vagy tdTomato képekből az átlagos fluoreszcenciajelek kivonására. Ezeket a jeleket %∆R/R-ben adtuk meg, mint a hivatkozásban. 49, hogy csökkentsük a mozgás hatását a méréseinkre. Az ingerek hiánya miatt az alapvonal R-t a GCaMP6s/tdTomato minimális arányaként számoltuk ki egy 2,5 s-os binárison belül.
Az aktivitás átmeneti növekedésének észlelésére egy algoritmust fejlesztettünk ki, amely részben a ref. 50. Először azt határoztuk meg, hogy a %∆R/R jel első deriváltja mikor lépett át egy küszöbértéket, amelyet egy adott neuronosztály (MDN, MAN vagy A1) összes derivált értékének vizsgálatával határoztunk meg. Úgy gondoltuk, hogy a küszöbértékeknek jellemzőnek és potenciálisan különbözőnek kell lenniük az egyes neurontípusok esetében, mivel a fluoreszcencia dinamikája olyan belső fiziológiai tulajdonságokhoz kapcsolódik, amelyek különbözhetnek az egyes neuronosztályok között, de nem az egy osztályra vonatkozó kísérletek között. Ezt a küszöbértéket az MDN-ek és dMAN-ek esetében a 97,5. percentilisnek, az A1 neuronok esetében pedig a 90. percentilisnek határoztuk meg. Az A1 neuronok esetében alacsonyabb küszöbértéket választottunk, mivel az A1 nyomokban sokkal több fluoreszcencia-tranziens volt megfigyelhető. Ezeket a tranzienseket a 97,5. percentilis küszöbérték használatával figyelmen kívül hagytuk volna. A fluoreszcencia-emelkedés kezdetének azonosításához megkerestük a legközelebbi megelőző időpontot, ahol a derivált átlépte a nullát. Ezt a nullátlépést tekintettük az azonosított fluoreszcencia-emelkedéshez kapcsolódó “esemény” időpontjának. Az egymáshoz közel észlelt eseményeket, amelyek között nem volt derivált nulla-átlépés, az első időponthoz tartozó egyetlen eseménybe tömörítettük. Állatonként ~10 különálló kísérletet végeztünk. Az egyes kísérletek első és utolsó 10 s-ában bekövetkező eseményeket nem vettük figyelembe, mivel az adatbemutatási ablak minden esemény előtt és után 10 s-t tartalmazott.
Mivel a bal és jobb oldali MDN és dMAN aktivitás erősen kovarált (Kiegészítő 5. ábra), egy további lépést végeztünk az eseménydetektáláshoz: ha a bal és jobb oldali neuronokban 2 s-on belül eseményeket detektáltunk, mindkét eseményt megtartottuk; ellenkező esetben az A neuronhoz azonosított eseményt (pl, bal MDN) és nem a B neuron (pl. jobb MDN) számára azonosított eseményt is hozzáadtuk a B neuron eseménytárához.
A bal és jobb A1 aktivitás ezzel szemben nem volt erős kovariációban. Ezért az események az egyik neuronhoz kapcsolódtak, a másikhoz pedig nem. Ennek érdekében, ha egy 0,25 s-os időablakon belül mind a bal, mind a jobb A1 neuronoknál észleltünk egy eseményt, egyik eseményt sem használtuk fel az elemzéshez.
%∆R/R és optikai áramlási nyomvonalakat, amelyek minden egyes eseményhez kapcsolódnak, összehangoltuk az eseményidőpontok 0 s-ra állításával. Ezután kiszámítottuk az átlagot és a bootstrapped 95%-os konfidenciaintervallumokat ezekhez az összehangolt nyomvonalakhoz a Python Seaborn könyvtár segítségével. Az optikai áramlás és a %∆R/R méréseket 500 s-1 értékre csökkentettük az elemzéshez. Az áttekinthetőség növelése érdekében a %∆R/R-nyomvonalakat alapvonal-szubsztraháltuk, hogy az összefoglaló paneleken (3d., 4d. és 5d, e. ábra) az esemény időpontjában nulla legyen. A kontroll, kevert adatokat (szürke nyomvonalak) úgy számoltuk ki, hogy a valódi, azonosított események helyett véletlenszerű időpontokat rendeltünk hozzá. Ezeket a véletlenszerű időpontokat valódi eseményekként kezeltük, és átlagukat és bootstrapped 95%-os konfidenciaintervallumaikat kiszámítottuk és ábrázoltuk az összehasonlításhoz.
A kovarianciaelemzést (5. kiegészítő ábra) egy egyedi Python szkript segítségével végeztük, amely a Matplotlib és a Numpy könyvtáraktól függött. Szórásdiagramokat számoltunk a bal és jobb neuron %∆R/R értékek összehasonlítására az összes kísérletből minden egyes légy esetében külön-külön. A Pearson’s r értékeket átlag ± standard eltérésként közöljük.
Az eseményhez kapcsolódó viselkedéseket (8., 10., 12. és 13. kiegészítő filmek) kézzel választottuk ki az automatikusan detektált események közül a fent leírtak szerint. A dMAN-ok esetében az eseményeket azok közül választottuk ki, amelyek maximalizálták az elülső-hátsó golyóforgások különbségét az eseményt megelőző 1 s és az eseményt követő 2 s között. Az MDN-ek esetében az eseményeket azok közül választottuk ki, amelyek az eseményt követő 2 s-ig minimalizálták a golyó elülső-hátsó forgását. Az A1 neuronok esetében az eseményeket azok közül választottuk ki, amelyek maximalizálták a golyó átlagos forgását (pozitív a bal A1 neuron példák esetében és negatív a jobb A1 neuron példák esetében) az eseményeket követő 2 s-ig.
A 8. kiegészítő ábrán a közeli infravörös lézer stimulációra adott válaszokat átlagoltuk minden állat esetében 10 kísérletre. Az optikai áramlás lemintavételezése 500 s-1 értékre történt. Az optikai áramlási nyomvonalak átlagát és 95%-os bootstrapped megbízhatósági intervallumát a Python Seaborn könyvtár segítségével mértük és ábrázoltuk. A Python Scipy könyvtárat használtuk a Friedman- és Mann-Whitney U-tesztek elvégzéséhez.