Biochemical and Pathogenic Properties ofShewanella alga and Shewanella putrefaciens

Eredmények

A Shewanella izolátumok biotipizálása két különböző séma szerint hasonló eredményeket hozott (1. táblázat). A legtöbb klinikai izolátum (74%) a Gilardi 2-es biovarba (CDC 2-es biotípus) tartozott, szacharóz és maltóz negatív volt, miközben SS-agaron és magas NaCl-koncentrációt tartalmazó táptalajon nőtt. Az egyetlen jelentős különbség a Gilardi-féle (6) és a Weyant és munkatársai (22) által alkalmazott osztályozási rendszer között az volt, hogy a 3. biovariánsú izolátumokat (szacharóz-, maltóz-, SS- és NaCl-negatívak) a CDC biotípus-meghatározási rendszere nem csoportosította. A humán izolátumokkal ellentétben a nem humán törzsek között az 1-es biovariáns (CDC 1-es biotípus) dominált (67%). Ezek a törzsek jellemzően maltózból és/vagy szacharózból termeltek savat, és nem szaporodtak magas sótartalmú vagy SS agaron. Nozue és mások (15) közelmúltbeli taxonómiai javaslatai alapján a biovár 2 (CDC 2. biotípus) törzseket S. alga-ként, míg az összes biovár 1 (CDC 1. biotípus) és a 7 biovár 3 törzsből 6 törzset S. putrefaciens-ként azonosították; a fennmaradó biovár 3 törzset később S. alga-ként azonosították. Klinikailag a S. alga dominált (77%), míg a nem humán izolátumok többségéről (89%) bebizonyosodott, hogy S. putrefaciens (1. táblázat).

Az API 20E, API NFT, RapID NF Plus és Vitek rendszereken végzett vizsgálatok során egy kivétellel mind a 10 Shewanella izolátumotS. putrefaciensként azonosították. Az öt S. putrefaciens izolátum közül négy az API 20E rendszeren elfogadhatatlan profilszámot produkált (0602026 és 0602006); az ötödik törzs ritka S. putrefaciens biotípusszámot generált. Az API 20E rendszeren valamennyi S. alga törzs kiválóan S. putrefaciensként azonosítható volt. Az API NFT rendszer mind a 10Shewanella izolátumot S. putrefaciensként azonosította, jó vagy kiváló azonosítással, egy kivétellel, amely szintén S. putrefaciens törzs volt (alacsony diszkriminációs érték, 48 h). A RapID NF Plus mind a 10Shewanella izolátumot S. putrefaciens-ként azonosította, 99,9%-os pontossággal. Hasonlóképpen az összes törzset a Vitek (97-99%-os pontossággal) S. putrefaciensként azonosította, bár három S. putrefaciens törzsnek 5-9 órás inkubációra volt szüksége a végleges azonosításhoz, szemben a másik 7 törzs 4 órás eredményével. Az API 20E, API NFT és Vitek rendszereken végzett szénhidrátreakciók (arabinóz és maltóz) azonban lehetővé teszik a legtöbb törzs helyes hozzárendelését a megfelelő taxonokhoz (S. putrefaciens ésS. alga), ha a végleges S. putrefaciensként történő azonosítást követően kézzel olvassák le.

A Shewanella fajok biokémiai és enzimatikus tulajdonságainak összehasonlítása számos különbséget tárt fel (2. táblázat). A Nozue és munkatársai (15) által közölt hemolízis juhvér agaron az összesS. alga törzsben kimutatható volt, de csak néhány S. putrefaciens izolátumban. A legtöbb S. alga törzs csak hosszabb inkubáció (48-72 óra) után mutatta ki ezt a fenotípust, és a hemolízis területe gyakran szabálytalan és nehezen kimutatható volt. Más, korábban a S. alga és a S. putrefaciens elkülönítését segítő tevékenységeket, mint például a 42 °C-on történő növekedés, a magas sókoncentrációt (6,5%) tartalmazó táptalajon történő növekedés, valamint az l-arabinózból, szacharózból és maltózból történő savtermelés, megerősítést nyertek. A korábban közölteknél lényegesen több S. putrefaciens törzset találtunk, amelyek SS-agaron növekedtek; ezek többsége nem humán forrásból származott. A ribóz kivételével a szénhidrátok oxidációjából származó savtermelés kizárólag a S. putrefacienshez kapcsolódott. A cukormintázat azonban jelentősen különbözött ezen izolátumok között, egyesek arabinóz, maltóz és szacharóz pozitívak voltak, míg mások csak a maltózra voltak pozitívak vagy aszacharolitikusak (3. biovariáns törzsek). A kiválasztott Shewanella izolátumok között számos új enzimaktivitást mutattak ki, amelyekről tudomásunk szerint korábban nem számoltak be. Ezek közé tartozott a tirozináz, alkilszulfatáz, kitináz és elasztáz aktivitás (2. táblázat); a legtöbb ilyen enzimet aS. putrefaciens nem humán izolátumaiban találták. A legtöbb S. alga ésS. putrefaciens törzs sziderofórt termelt, amint azt a Chrome Azurol S tesztekkel megállapították. Ez az aktivitás gyenge volt, és öt izolátum (három S. alga és két S. putrefaciens izolátum) nem növekedett ezen a táptalajon.

A kiválasztott Shewanella izolátumokat, amelyek 35°C-on jól növekedtek, tovább jellemeztük enzimatikus aktivitás szempontjából az API-ZYM segítségével (3. táblázat) és a sejtek zsírsavprofiljait a MIDI rendszerrel. Az API-ZYM segítségével az egyik vagy mindkét Shewanella faj által megtámadott kilenc szubsztrát közül hét enzim esetében a magasabb összesített aktivitás az S. algához társult. Az egyetlen aktivitás, amely a S. putrefaciensben erősebbnek bizonyult, a valin arilamidáz volt, bár ez az aktivitás még ezekben a törzsekben is rendkívül gyenge volt. Mindkét faj egységesen erős alkalikus foszfatáz aktivitást produkált. További megfigyelés volt, hogy az összes S. alga törzs a kilenc enzimből nyolcat következetesen termelt, az egyetlen kivétel a valin-arilamidáz volt. Ezzel szemben a S. putrefaciens heterogénebb volt, a kilenc kimutatott enzim közül négy nem volt minden izolátumban általánosan jelen. A 14Shewanella-törzs elemzése azt mutatta, hogy az uralkodó zsírsavak az i-15:0, 17:1ω8c és 16:0 voltak; egyes törzsek nagy mennyiségű 16:1ω7c-t termeltek (9-18%), míg mások elhanyagolható mennyiséget. Míg a legtöbb zsírsavcsúcs meglehetősen egységes volt a vizsgált S. alga és S. putrefaciens törzsek között, számos különbséget észleltünk (4. táblázat). A pentadecánsav és a cis-9-heptadecénsav (17:1ω8c) magasabb átlagértékeit figyelték meg a S. alga esetében, míg a hexadecánsav és a dodekánsav esetében ez fordítva volt igaz a S. putrefaciens esetében. A hexadecánsav esetében a S. alga és a S. putrefaciens között nem volt átfedés a teljes zsírsavtartományban; a pentadecánsav és a 17:1ω8c esetében csak az egyik S. putrefaciens vagy S. alga izolátum produkált olyan értéket, amely a másik izolátum tartományába esett. Bár egyetlen csúcs sem volt diagnosztikus, mind a négy csúcs együttes használata egyértelműen két csoportra osztotta a 14Shewanella-törzset a fajok mentén.

Az S. putrefaciens 23 törzsét több fenotípusos jellemző alapján három külön csoportra lehetett bontani (5. táblázat). Az 1. csoport, amely nyolc törzsből, köztük az ATCC 8073-ból állt, maltózból, szacharózból és arabinózból termelt savat, és urokánsavat használt. Az 1. csoport törzsei egyenlő arányban oszlottak meg a klinikai és a nem humán izolátumok között. A 2. csoportba tartozó törzseket (n = 6), köztük az ATCC 8071-et, elsősorban a szacharóz és a maltóz oxidálására való képtelenség különböztette meg az 1. csoportba tartozó törzsektől. E törzsek fele ismét klinikai anyagból származott. A 3. csoportba tartozó törzsek (n = 9), amelyek mind környezeti eredetűek (Michigan-tó környéke), drámaian különböztek az 1. és 2. csoporttól. Gyengén vagy egyáltalán nem növekedtek 35 °C-on, kitinázt termeltek, és nem voltak pigmentáltak a triptofán agaron. A 3. csoport mind a kilenc törzse kezdetben α-glükozidázt termelt, de az ismételt vizsgálat során csak három törzs volt következetesen pozitív. A maltózt oxidálták, de a szacharózt vagy arabinózt nem. Az 1. és 2. csoporttal ellentétben az urokánsavat nem hasznosították energiaforrásként.

A közelmúltban Vogel és munkatársai (21) az S. alga és a S. putrefaciens között különbségeket figyeltek meg bizonyos antimikrobiális szerekkel, köztük a penicillinnel, ampicillinnel és tetraciklinnel szembeni érzékenységükben. Ez, valamint az S. alga hemolitikus aktivitásával és az emberi betegségekkel való nyilvánvaló kapcsolatával kapcsolatos jelentés arra utal, hogy e két faj patogenitásában lehetséges különbségek vannak (6. táblázat). Ezért 10 törzset választottunk ki (mindkét fajból 5-öt) további elemzésre. Bár a penicillin, ampicillin és tetraciklin iránti fogékonyságban nem észleltünk jelentős különbségeket e két csoport között a fogékonysági kategória (fogékony, közepes vagy rezisztens) alapján, azt tapasztaltuk, hogy az S. alga esetében a penicillin, ampicillin és tetraciklin átlagos MIC-értékei (∼200, 56 és 5.2 μg/ml, illetve) nagyobbak voltak, mint a S. putrefaciens megfelelő MIC-értékei(3, 1,3, illetve 1,1 μg/ml).

Öt S. putrefaciens törzsből négy gyengén (+) vagy erősen (+++) (6. táblázat) tapadt HEp-2 sejtekhez tapadási vizsgálatokban; ezzel szemben egyetlen S. alga törzs sem mutatott hasonló tapadási tulajdonságokat, bár négy törzs erősen kötődött az üveglemez hátteréhez. Invazív aktivitást egyikShewanella-törzsben sem mutattak ki. Bár mind az öt S. alga-törzs esetében késleltetett hemolitikus reakciót figyeltek meg juhvér-agaron (2. táblázat), béta-hemolízist nem észleltek az agar overlay technikával vagy a táptalajvizsgálatokkal (6. táblázat); a kontroll E. tarda törzsek mindkét vizsgálatban 1 óra alatt pozitívak voltak. Mind az öt S. alga törzs (és egy S. putrefaciens izolátum) esetében néha gyenge citotoxikus reakciót figyeltek meg az adhéziós és inváziós vizsgálatok során. Ez a citotoxikus reakció abnormális sejtmorfológiájú HEp-2 sejtek megjelenésében nyilvánult meg, beleértve a sejttörmeléket (szellemeket). A két faj egérpatogenitásában azonban különbségeket találtak e két faj között, mivel az átlagos LD50 svájci Webster egerekben a S. alga esetében 1,9 × 108 CFU volt, míg a S. putrefaciens esetében 8,4 × 108 CFU (P < 0,02).