AMDock: sokoldalú grafikus eszköz a molekuláris dokkolás segítésére az Autodock Vina és az Autodock4 segítségével

A molekuláris dokkolás a vezető felfedezés és optimalizálás hatékony eszközévé vált. Az elmúlt három évtizedben számos dokkolóprogramot fejlesztettek ki, amelyek különböző keresési algoritmusokon és pontozási függvényeken alapulnak. Azzal a céllal, hogy ezeket a dokkoló programokat felhasználóbarátabbá tegyék, különösen a kezdők számára, különböző grafikus felhasználói felületeket (GUI) fejlesztettek ki, amelyek segítik a molekuláris rendszerek előkészítését, a számítások végrehajtását és/vagy az eredmények elemzését. A rendelkezésre álló (többnyire az AutoDock és/vagy Autodock Vina számára kifejlesztett) GUI-k példái a PMV grafikus csomagba integrált AutoDock Tools (ADT) , BDT , DOVIS , VSDocker , VSDocker , AUDocker LE , WinDock , DockoMatic , PyMOL AutoDock plugin (PyMOL/AutoDock) , PyRx , MOLA , DockingApp és JADOPPT .

Ezzel egy új multiplatformos eszközt, az AMDock-ot (Assisted Molecular Docking) mutatjuk be, amelynek fő előnye elődeivel szemben az, hogy számos értékes külső eszközt integrál egy egyszerű és intuitív grafikus felületen, amely a jól bevált dokkolási protokollok mentén vezeti a felhasználókat – az Autodock4 vagy az AutoDock Vina használatával – a rendszer előkészítésétől az eredmények elemzéséig.

Funkcionalitások és munkafolyamatok

AzAMDock integrálja az Autodock Vina és az Autodock4, az ADT szkriptek, az AutoLigand , az Open Babel , a PDB2PQR és a PyMOL funkcióit. Az aktív központban cinkiont tartalmazó fehérjék esetében az AMDock lehetőséget biztosít a speciálisan testre szabott Autodock4Zn paraméterek használatára. Az AMDock Python 2.7-ben van kódolva, és elérhető Windows és Linux rendszerre. Windowson az összes integrált eszközzel együtt van csomagolva, így nincs szükség további szoftverek telepítésére. Linuxon csak az Open Babel-t és a PyMOL-t kell telepíteni (mindkét eszköz megtalálható a legtöbb népszerű Linux-tárban).

Az AMDock főablakának öt füle van: 1) Kezdőlap, 2) Dokkolási beállítások, 3) Eredményelemzés, 4) Konfiguráció és 5) Info. Az AMDock funkcióit és munkafolyamatát az alábbiakban összefoglaljuk (1. ábra), majd ezt követően részletesebben tárgyaljuk.

A “Home” fülön a felhasználó kiválaszthatja a dokkolómotort: Autodock Vina vagy Autodock4, és további lehetőség van az Autodock4Zn paramétereinek használatára. Ezután a felhasználó automatikusan a “Docking Options” fülre kerül, amely négy panelt tartalmaz, amelyek a dokkolási szimuláció szekvenciális előkészítését irányítják.

Bemeneti fájlok az AMDock számára

Mindössze a ligandum és a receptor molekulák kartéziánus koordinátáira van szükség, amelyek több elterjedt struktúraformátumban is megadhatók, pl. a fehérje esetében PDB vagy PDBQT, a ligandum esetében pedig PDB, PDBQT vagy Mol2. Ha a fehérje koordinátái egy kötött ligandummal együtt érkeznek, akkor az utóbbi koordinátáit tárolja, és utólag felhasználható a keresési tér meghatározásához.

A program három fő lépést követve működik:

1. 1-

   A dokkoló bemeneti fájlok előkészítése: Először a felhasználó beállíthat egy pH-értéket mind a ligandum (opcionális, alapértelmezett érték 7,4) protonálására az Open Babel segítségével, mind a fehérje (alapértelmezett érték: 7,4) protonálására a PDB2PQR segítségével. Két különböző dokkolási lehetőség áll rendelkezésre: a) “egyszerű dokkolás”, egyetlen fehérje-ligandum komplex kötődési módjának előrejelzésére, és b) “off-target dokkolás”, a ligandum két különböző receptorhoz, azaz a célponthoz és az off-targethez való kötődési pózok előrejelzésére. Végül az ezen a lapon található “Scoring” opció lehetővé teszi egy már létező fehérje-ligandum komplex pontozását az Autodock Vina, Autodock4 vagy Autodock4Zn funkciók segítségével. A dokkolási vagy pontozási protokoll kiválasztása után a bemeneti fájlok elkészítése ADT szkriptek segítségével történik.

2. 2-

   A keresési tér meghatározása: Négy különböző megközelítés használható a doboz középpontjának és méreteinek meghatározására: a) “Automatikus” – a program az AutoLigandot használja a lehetséges kötőhelyek előrejelzésére, majd minden egyes AutoLigand objektumra egy optimális méretű doboz kerül középre,1. lábjegyzet minden előre jelzett kötőhelyen. b) “Center on Residue(s)” – az AutoLigandot használjuk a ligandum méretének megfelelő térfogatú objektum létrehozására, referenciaként a kiválasztott maradékok geometriai középpontját használva. Ezután egy optimális méretekkel rendelkező doboz kerül a generált objektum középpontjába. c) “Center on Hetero” – a doboz egy meglévő ligandum geometriai középpontjára kerül (ha a receptor egy ligandummal komplexben adott), és d) “Box” – a doboz középpontját és méreteit a felhasználó határozza meg. A fenti módszerek bármelyikével létrehozott doboz megjeleníthető a PyMOL-ban, és a PyMOL menüablakába ágyazott új AMDock plugin (adaptálva a ) segítségével könnyen módosítható a felhasználó igényei szerint.

3. 3-

   A dokkolási szimulációk futtatása és az eredmények elemzése: A molekuláris dokkolási számítások futtatása után (a “Run” gombra kattintva indítva) a felhasználó automatikusan az “Results Analysis” (Eredmények elemzése) fülre kerül, ahol az affinitás, a becsült Ki értékek és a Ligand Efficiencies (Ligand Hatékonyság) listázásra kerülnek a különböző kötési pózokhoz.

A becsült Ki egy nagyon hasznos érték, mivel az affinitáshoz képest jobban kapcsolódik az általában mért kísérleti paraméterekhez. A ligandum hatékonysága (LE) másrészt fontos informatív paraméter a vezető vegyület kiválasztásakor . Itt a LE-t a következő egyenlet segítségével számítják ki:

melyben ΔG a kötés szabad energiája vagy a számított pontszámérték, HA pedig a ligandum nehéz (nem hidrogén) atomjainak száma. Az LE > 0,3 értékű vegyületek potenciális vezető vegyületekként vannak kiemelve .

A “Show in PyMOL” gomb elindítja a PyMOL-t a receptor és a kiválasztott póz közötti komplex személyre szabott megjelenítésével (alapértelmezés szerint a legalacsonyabb energiájú ligandum póz van kiválasztva). Az így kapott adatok a folyamat során egy fájlban (*.amdock) tárolódnak, amely később bármikor felhasználható az eredmények vizsgálatára.

A “Configuration” fülön különböző dokkolási paraméterek állíthatók be, míg az “Info” fül, hozzáférést biztosít a praktikus dokumentációhoz, beleértve egy felhasználói kézikönyvet és hivatkozásokat.

Vizualizáció

AMDock a PyMOL-ra támaszkodik a vizualizáció két különböző szakaszában: 1) a rácsdoboz helyének és méreteinek (a keresési tér) beállítása, és 2) a dokkolási eredmények elemzése. A PyMOL egy sokoldalú és felhasználóbarát molekulaelemző program, amely emellett lehetővé teszi a publikáláshoz szükséges kiváló minőségű képek készítését is. A két szakaszhoz az AMDock programban több előre meghatározott PyMOL ábrázolást kódoltunk, kiválasztva az általunk minden esetben optimálisnak ítélt vizuális kialakítást és információt. Ezeket az előre meghatározott reprezentációkat a felhasználó a PyMOL-on belül módosíthatja.

Keresési tér

Az előre meghatározott reprezentációk (a komplexitás csökkenő sorrendjében, a vizualizációs tartalom elemeinek száma szerint) a következők: 1) Doboz – egyszerű ábrázolás, ahol a vizsgált fehérje karikatúraként jelenik meg, a felhasználó által meghatározott specifikációkat tartalmazó dobozzal együtt (2a. ábra); 2-Centered on Hetero – tartalmazza a receptorfehérjét (karikatúra) és a kiválasztott korábbi ligandumra (pálcikák) központosított optimális méretű dobozt (2b. ábra); 3-Centered on Residue(s) – olyan ábrázolás, amely lehetővé teszi a felhasználó számára a keresési tér meghatározásához kiválasztott maradékok azonosítását. A fehérje karikatúraként, a kiválasztott maradékok pálcikaként, az AutoLigand objektum pedig pontként van ábrázolva. A kiszámított doboz is megjelenik, így a felhasználó könnyen ellenőrizheti és (ha szükséges) beállíthatja a pozícióját és méreteit (2c. ábra). 4-Automatikus – Itt egy egyszerűsített ábrázolást kívántunk létrehozni az AutoLigand által megjósolt összes kötőhely bemutatására. A fehérje karikatúrában, az egyes AutoLigand objektumok pálcikákkal ábrázolva, a szomszédos maradékokra épített felülettel körülvéve. Mivel az AutoLigand által prediktált minden egyes kötőhelyre dokkolási szimulációkat kell végezni, minden egyes kötőhelyhez egy doboz generálódik, de csak a felhasználó által kiválasztott kötőhelyet mutatja (2d. ábra). Mint már említettük, bármelyik változatban a doboz középpontja és mérete könnyen módosítható a PyMOL-ban implementált AMDock plugin segítségével.

Eredményelemzés

A fehérje karikatúrában van ábrázolva. Az egyes ligandpózok pálcikákkal vannak rajzolva, a fehérjével való poláris kontaktusait pedig szaggatott vonalakkal ábrázoljuk. Hasonló megjelenítésre van lehetőség mindkét fehérje esetében, ha az “Off-Target Docking” eljárást választottuk (3c. ábra). Ez lehetővé teszi a ligandum pózok egyidejű összehasonlítását mind a cél-, mind az off-target fehérjék esetében.

Egy esettanulmány: A SAR405 kötődési szelektivitás – PI3Kγ vs. Vps34

A foszfatidil-inozitol-3-kináz (PI3K) a növekedésben, proliferációban, motilitásban, túlélésben és intracelluláris forgalomban részt vevő enzim . A PI3K ígéretes rákellenes célpont is, számos gátlója már klinikai stádiumban van. Néhány ilyen inhibitor jelenleg III. fázisú klinikai vizsgálatokban van, és egyikük, az alpelisib nemrég (2019 májusában) megkapta az FDA engedélyét az áttétes emlőrák kezelésére.

A PI3K-nak több izoformája van, amelyeket 3 különböző osztályba sorolnak. Az I. osztály négy különböző izoformát foglal magában (α, β, γ és δ), míg a III. osztály egyetlen fehérjéből, a Vps34 nevű fehérjéből áll. A szekvencia- és szerkezeti hasonlóságok miatt egyes inhibitorok különböző izoformákhoz kötődhetnek, míg számos más inhibitort úgy terveztek, hogy izoforma-specifikusak legyenek. Kutatócsoportunk jelenleg olyan PI3K-inhibitorok azonosítására összpontosít, amelyek képesek gátolni a különböző patogén mikroorganizmusokban található PI3K ortológokat, amelyek csak az ősi Vps34 izoformát expresszálják. Ehhez az AMDock értékes eszközt jelent, különösen az “Off-Target Docking” opciója. Itt bemutatjuk a használatát egy olyan feladattal, amely hasonlít a saját kutatómunkánkhoz.

A Sar405 a Vps34 egy nagyon specifikus inhibitora (IC50 = 1,2 nM), míg a többi izoforma esetében az IC50 > 104 nM . A SAR405-nek a humán Vps34-gyel komplexben lévő kristályszerkezete elérhető a Protein Data Bankban (PDB kód: 4oys). Itt a humán Vps34-et használjuk “Target” receptorként, míg a PI3K gamma izoformát (PDB: 3apf) “Off-Target” receptorként. Mindkét struktúra tartalmaz kötött ligandumot az aktív centrumban, ami kényelmes a rácsdoboz generálásához. Első lépésben kiválasztjuk a dokkoló programot (Autodock Vina), majd ezt követően létrehozunk egy projektmappát a számítógép merevlemezén. Miután betöltöttük mindkét fehérjeszerkezetet, kihasználva szekvencia-hasonlóságukat, a PyMOL segítségével kihasználjuk a struktúrák összehangolásának és egymásra helyezésének rendelkezésre álló lehetőségét, ami lehetővé teszi egy közös keresési tér meghatározását és leegyszerűsíti a dokkolási eredmények későbbi elemzését. Ezután a bemeneti fájlok automatikus előkészítése következik, amely magában foglalja a titrálható maradékok protonálását, a nem poláris hidrogének összevonását és az ionok/víz eltávolítását. A doboz középpontját a kötött ligandumok geometriai középpontja alapján határozzuk meg (3a. ábra), míg a doboz méretét a dokkolandó ligandum , azaz jelen esetben a SAR405 inhibitor giroszkópiájának sugara alapján. A kezdeti ligandum-konformációt (annak torziós szögeit) az ADT segítségével randomizáltuk.

A folyamat befejeztével az eredmények azt mutatják, hogy a SAR405 a Vps34-re szelektívebb (- 9,2 kcal/mol), mint a Pi3Kγ-re (- 7,3 kcal/mol), ahogyan az várható volt (3b. ábra). A SAR405 prediktált kötési póza a Vps34-ben közel áll a kristálygeometriához (rmsd = 1,9 Å az összes ligandumatomra, rmsd = 0,5 Å a gyűrűmagra). A komplex előre jelzett Ki értéke is a nanomoláris tartományban van, ami megegyezik a kísérleti értékkel. Másrészt a Pi3Kγ-SAR405 komplexre sokkal magasabb Ki értéket jósolnak, és a megjósolt kötési póz jelentősen eltér a kristályográfiai szerkezettől (rmsd = 4,7), amint az a 3c. ábrán látható, ami megmagyarázhatja az AutoDock Vina által jósolt gyenge affinitási értéket. Ezt a tanulmányi esetet oktatóanyagként beépítettük a felhasználói kézikönyvbe, amely az AMDock telepítési mappájában és a Githubon található wikiben (https://github.com/Valdes-Tresanco-MS/AMDock-win/wiki/4.3-Off-target-docking) található.

Diszkusszió

Az AMDock egy újszerű, könnyen használható és sokoldalú felületet biztosít két, különböző funkcionalitással és jellemzőkkel rendelkező molekuláris dokkolómotorral, az Autodock4 és az Autodock Vina-val való munkához. Az AMDock nagyon hasznos lehet a dokkolóprogramokkal való munkában kevés tapasztalattal rendelkező kutatók számára, mivel nincs szükség előzetes ismeretekre e programok sajátos működéséről. Az AMDock környezet három különböző munkafolyamatot (egyszerű dokkolás, célponton kívüli dokkolás és pontozás) tartalmaz. Az off-target dokkolási eljárást különösen hasznosnak találjuk a ligandum-szelektivitási vizsgálatok elvégzéséhez – ami a gyógyszertervezési folyamat kritikus lépése.

A bemeneti fájlok megfelelő és következetes előkészítése, valamint a keresési tér helyes definiálása kritikus kérdések a molekuláris dokkolási vizsgálatok elvégzése során. Az AMDockba számos külső program/szkript van integrálva, amelyek lehetővé teszik a bemeneti fájlok minimális erőfeszítéssel történő előkészítését, miközben a folyamat ellenőrzése megmarad. Az AMDock az OpenBabel-t és a PDB2PQR-t használja a ligandum, illetve a receptor protonálására, míg a bevezetőben említett többi GUI az ADT-t használja mind a receptor, mind a ligandum protonálására (kivéve a DockingApp-ot, amely szintén az OpenBabel-t használja a ligandum protonálására).

A keresési tér meghatározásához az AMDock számos lehetőséget kínál a rácsdoboz pozíciójának beállítására különböző forgatókönyvekben, míg a bemeneti ligandumot alapértelmezés szerint a doboz optimális méreteinek meghatározásához használja, ami csökkenti a számítási költségeket a dokkolási folyamat optimalizálása során . Ebben a tekintetben csak az ADT és a PyMOL/AutoDock plugin kínál korlátozott lehetőségeket a felhasználó által meghatározott keresési téren kívül, de a doboz méretét minden esetben a felhasználónak kell meghatároznia. Néhány ilyen GUI-ban, mint például a DockingApp-ban, a keresési tér a teljes receptort lefedi, ami további számítási költségekhez vezet, és esetleg veszélyezteti a szimulációk pontosságát. Más GUI-k esetében a felhasználónak külső alkalmazást, például ADT-t kell használnia a doboz paramétereinek meghatározásához.

A “Centered on Residue(s)” opció előnyösebb, ha a kötőhelyi maradékok ismertek. Ezzel az opcióval a kiválasztott maradékok geometriai középpontjába helyezett objektumot generál az AutoLigand a fehérje felületén. Ez az eljárás optimalizálja a keresési tér helyét és méretét is. Ha a dobozt a kiválasztott maradékok geometriai középpontja helyett a kiválasztott maradékok geometriai középpontjára helyeznénk, akkor annak egy jelentős része valószínűleg beágyazódna a fehérjébe, ami nagyobb méretet követelne meg a szükséges mintavételi tér lefedéséhez (4. ábra). A “Centered on Hetero” alternatíva hasznos a kristályográfiai szerkezetű komplexek redocking-vizsgálataihoz vagy a hasonló kötési móddal rendelkező ligandumok vizsgálatakor (2b. ábra). Az “Automatikus” opció viszont akkor kívánatos, ha a kötőhelyre vonatkozó információ nem áll rendelkezésre. Ebben az esetben az AutoLigand által megjósolt minden egyes kötőhelyhez egy független dokkolási futtatást hajtunk végre (2d. ábra). Ily módon az AutoLigand rangsorolási módszerből származó információk kombinálódnak a dokkoló motor információival, anélkül, hogy a prediktált helyek közül önkényesen kiválasztanánk egyet. Ez a folyamat automatikusan történik, és az eredmények minden egyes előre jelzett kötőhelyre vonatkozóan megjeleníthetők a PyMOL-ban. Összességében a doboz meghatározása és vizualizációja minimális erőfeszítéssel jár, és bármikor módosítható, így nemcsak a kezdő felhasználók, hanem a szakértők számára is előnyt jelent.

Azért érdemes megjegyezni, hogy a doboz méretét Angströmben szabványosítottuk, hogy elkerüljük a gyakran előforduló hibákat, amelyekről különböző fórumokon és levelezőlistákon számoltak be. Ezek a hibák abból adódnak, hogy az AutoDockban (pontok száma + rácsköz) és az Autodock Vina-ban (angströmben) a dobozméretek eltérő módon vannak definiálva, és a keresési tér nagyon kicsi vagy túl nagy lehet, ami végső soron következetlenségekhez vezethet a kapott dokkolási eredményekben.

Az AMDock integrációja a PyMOL-lal jelentős előnyt jelent. A PyMOL ugyanis egy széles körben használt, nagy közösségi támogatással és aktív fejlesztéssel rendelkező molekulakereső program. A PyMOL-on belül a dokkolási eredmények több eszközzel is elemezhetők, különösen a nagy teljesítményű Protein-ligand Interaction Profiler segítségével . Más alkalmazások, például az ADT, a PyRx vagy a DockingApp saját grafikus nézőkkel rendelkeznek. A PyRx és a DockingApp egyszerű megoldásokat kínál korlátozott analitikai képességekkel, míg az ADT csak a fehérje-ligandum kölcsönhatások egyszerű elemzését teszi lehetővé.

Az AMDockkal továbbá lehetőség van arra, hogy az AutoDock Zn erőtérrel indítsunk dokkolási szimulációkat metalloproteinekre, ami az ADT-ben csak parancssoron keresztül érhető el. Az off-target dokkolási opciója, amely nagyon hasznos a gyógyszer-repurposing vizsgálatokhoz, csak a Dockomaticban és a PyRxben érhető el (az utóbbiban csak a fizetős verzióban).

A dokkoló GUI-k többsége a virtuális szűrésre összpontosít. Az AMDock jelenleg nem támogatja a virtuális szűrést, azonban jelenleg dolgozunk a megvalósításán, hogy a következő programverzióban elérhetővé tegyük.

Végezetül, és mivel az ADT valószínűleg a legszélesebb körben használt dokkoló GUI, részletesebb összehasonlítást nyújtunk az AMDock és az ADT között (1. táblázat).

Következtetések

Az AMDock egy felhasználóbarát GUI, amely rendkívül intuitív és interaktív módon működik, és lehetővé teszi az Autodock4 és AutoDock Vina molekuláris dokkolási vizsgálatok elvégzését minimális beállítási erőfeszítéssel. Ezek a tulajdonságok teszik az AMDockot vonzó eszközzé oktatási célokra is. Az AMDock olyan funkciókat és eljárásokat gyűjt össze, amelyek más hasonló programokban nincsenek jelen. Tartalmazza az AutoDock legújabb fejlesztéseit, például az Autodock4Zn paraméterezést. Csoportunk számára az AMDock nagyon hasznos volt a különböző PI3K-inhibitorok ortológ fehérjékkel szembeni szelektivitási profiljának becslésében több mikroorganizmusban. A további fejlesztések (hidratált ligandum, kovalens dokkolás és virtuális szűrés) dokkolási lehetőségként szerepelnek majd a jövőbeli verziókban.