Cellelinjer
Cellelinjerne og deres kilder er som følger: 293T (ATCC CRL-11268), 786-O (ATCC CRL-1932) og HK-2 (ATCC CRL-2190). THP-1-celler blev venligst stillet til rådighed af Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences. Cellerne blev dyrket i DMEM (for 293T og 786-O), MEM (for HK-2) eller RPMI 1640 (THP-1) medium med 10 % føtalt kvægserum og 2 mM l-glutamin ved 37 °C i tilstedeværelse af 5 % CO2. Før infektion med bakterier, behandling med proteiner eller kemotaxisanalyse blev mediet ændret til serumfrit medium.
Bakteriestammer og plasmider
De bakteriestammer og plasmider, der er anvendt i denne undersøgelse, er anført i Supplerende tabel S3. E. coli-stammer blev dyrket ved 37 °C i Luria-Bertani (LB)-medium under statiske forhold i 12 timer med passende antibiotika, når det var nødvendigt, i følgende koncentrationer: Kanamycin på 50 μg/ml, ampicillin på 100 μg/ml og kloramfenicol på 15 μg/ml. ΔhlyA-stammen blev genereret ved at erstatte hlyA med et cat-gen ved hjælp af λ-Red-rekombinase. For at generere ∆hlyA p-hlyA-stammen blev hlyA-genet amplificeret ved PCR fra kromosomet af UPEC-stammen CFT073 og ligeret ind i pTRC99A ved KpnI- og XbaI-enzymstederne, og plasmidet blev transformeret til ∆hlyA ved elektroporation. HlyC- og hlyA-generne fra CFT073 eller det komplementære DNA (cDNA), der koder for Nectin-2, blev amplificeret ved PCR og klonet ind i pET-28a ( + ) for at fremstille aktive FLAG- eller HA-mærkede HlyA- eller Nectin-2-rekombinante proteiner. For at fremstille inaktivt FLAG-mærket HlyA (pro-HlyA) blev hlyA-genet uden hlyC fra CFT073 klonet ind i pET-28a ( + ) ved XbaI- og XhoI-enzymsteder. Myc-mærkede Nectin-2 blev integreret i pLenti-Hygro-vektoren til transfektion.
HlyA, pro-HlyA og human Nectin-2 rekombinant proteinekspression og oprensning
Ekspression af rekombinant HlyA eller pro-HlyA blev udført i E. coli BL21 (DE3), og ekspression af Nectin-2 blev udført i Rosetta (DE3). Før induktion med 100 μM IPTG blev bakterier dyrket ved 37 °C, indtil de nåede en OD600 på 0,6 til 0,8. De dyrkede bakterier blev opsamlet ved centrifugering (8000 × g i 5 min. ved 4 °C) efter 12 timers induktion ved 16 °C i LB med IPTG. Bakterierne blev lyseret med lysozym og ultralyd, og supernatanten blev centrifugeret for at fjerne partikler (18 000 × g i 30 min. ved 4 °C). Proteinerne blev derefter oprenset ved hjælp af Ni-NTA Purification System (GenScript, Nanjing, Kina). Proteinerne blev elueret med 250 mM imidazol. Fraktioner med HlyA-fragmenter blev samlet, dialyseret i 150 mM imidazol, 50 mM imidazol og to gange med PBS. Efterfølgende blev fraktioner, der indeholdt det ønskede protein, koncentreret til 500 μl ved hjælp af Amicon Ultra-15 Centrifugalfilterenheder (Millipore, Burlington, MA, USA). Den sidste dialysebuffer, der havde et lignende ionisk miljø som det oprensede HlyA-protein, blev anvendt som kontrol for det oprensede protein i eksperimenterne. Den endelige proteinkoncentration blev bestemt spektrofotometrisk (Nanodrop-2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ved hjælp af BCA Protein Assay Kit (23225, Thermo Scientific).
Mus pyelonephritis model
Alle dyreforsøg blev gennemgået og godkendt af Komitéen for Dyrepleje og -anvendelse ved Tianjin Medical University, Tianjin, Kina. Vi gjorde alt for at minimere dyrenes lidelser og for at reducere antallet af anvendte dyr. Hun-C57BL/6J-mus i alderen 6-8 uger blev købt fra Academy of Military Medical Science (Beijing, Kina). Den akutte pyelonefritis musemodel blev etableret som tidligere beskrevet.53 Bakterierne blev dyrket natten over i statisk LB-medium ved 37 °C. De dyrkede bakterier blev pelleteret ved centrifugering (5000 × g i 5 minutter ved 4 °C) og resuspenderet i PBS for at opnå en tæthed på 2 × 1010 CFU/ml. Med 3 timers mellemrum blev bedøvede hunmus C57BL/6J-mus intrauretrisk inokuleret med 50 μl UPEC-stammer (109 CFU) to gange.54,55 Ved 12, 24 og 48 hpi blev musene ofret, og deres nyrer blev aseptisk fjernet og homogeniseret i 1 ml PBS indeholdende 0,025 % Triton X-100 og derefter fortyndet serielt med henblik på bakterieoptælling. Ved 24 hpi blev nyrevævet også brugt til flowcytometri, histologi og analyse af proinflammatoriske cytokiner.
Flowcytometrianalyse
Encelle-suspensioner blev genereret ved fordøjelse med 1,5 mg/ml collagenase IV (C5138, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 100 ng/ml DNase I i PBS i 30 min ved 37 °C under let rystning. De fordøjede cellesuspensioner blev derefter filtreret gennem en 70-μm cellefilter (352350, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) for at opnå enkeltcellesuspensioner. Fc-receptorer blev blokeret ved hjælp af CD16/32 (101319, Biolegend, San Diego, CA, USA), og enkeltcelle-suspensionerne blev derefter inkuberet med følgende antistoffer: anti-CD11b konjugeret til APC (17-0112-82, Thermo Fisher Scientific), anti-Ly6G konjugeret til PE (127608, Biolegend), anti-F4/80 konjugeret til FITC (11-4801-82, Thermo Fisher Scientific), anti-CD11c konjugeret til PE (127608, Biolegend), anti-CD206 konjugeret til PerCP/Cy5.5 (141716, Biolegend). Cellerne blev analyseret på et FACSCanto II flowcytometer (BD Biosciences) ved hjælp af Flow Jo-softwaren (FlowJo, Ashland, OR, USA).
H&E-farvning og immunohistokemi
Nyrerne blev fikseret i 10 % fosfatbufferet formalin i mindst 24 timer. Det fikserede væv blev derefter indlejret i paraffin og skåret i 5 μm snit. Objektiverne blev farvet med hæmatoxylin og eosin. Nyrehistopatologiske ændringer blev vurderet ved hjælp af en 6-punktsskala, hvor 0, 1, 2 og 3 indikerede normale, milde, moderate og alvorlige histologiske læsioner (patologiske skader var hovedsageligt lokaliseret i medulla og kortikal-medullarovergangen); i mellemtiden indikerede 4, 5 og 6 milde, moderate og alvorlige histologiske læsioner (patologiske skader var hovedsageligt lokaliseret i flere dele af nyren). Histologiske undersøgelser blev analyseret af to personer, der var blinde for forsøgsgrupperne.56,57 Til immunohistokemisk analyse blev sektioner farvet med anti-Nectin-2 antistof (27171-I-AP, 1:200, Proteintech, Chicago, IL, USA). Billeder blev optaget under et mikroskop (BX46, Olympus, Tokyo, Japan).
Immunofluorescensanalyse af væv og celler
Nyrerne blev indlejret i OCT-forbindelse med flydende nitrogen. Frosne blokke blev skåret i 5 µm sektioner og lufttørret ved stuetemperatur i 1 time og fikseret med kold acetone i 10 minutter. De frosne sektioner blev derefter straks nedsænket i methanol i 20 min og derefter i methanol med 3% hydrogenperoxid i 10 min. Vævene blev blokeret med 5 % bovin serumalbumin (BSA) i 1 time, inkuberet med anti-F4/80 antistof (ab6640, Abcam, 1:200), anti-Ly6G antistof (ab210402, Abcam, 1:200), Nectin-2 antistof (ab135246, Abcam, 1:200) i blokeringspuder natten over ved 4 °C, når det var nødvendigt. Objektglassene blev derefter vasket fem gange med PBS og inkuberet med Alexa Fluor 488/549-mærket sekundært antistof (Proteintech, 1:200) i 1 time ved stuetemperatur. For at visualisere kerner blev vævsafsnit modfarvet med DAPI. Billeder blev optaget under et fluorescerende mikroskop (IX73, Olympus). De 293T-celler, der var transficeret med pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2, blev dyrket på et Lab-Tek-kammerdækglas og behandlet med 75 nM HlyA i 6 h, fikseret med 4 % paraformaldehyd i 15 min og underkastet immunofluorescensfarvning med anti-MYC-Tag-antistof (66003-2-Ig, 1:25, Proteintech) og HA-Tag-antistof (2367S, 1:200, CST) ved 4 °C natten over. Alexa Fluor 488/594-mærket andet antistof (Proteintech) blev anvendt ved inkubation ved stuetemperatur i 1 time. Cellerne blev afbildet ved hjælp af et konfokalt fluorescensmikroskop (FV1000-D, Olympus).
Infektion af nyreepitelceller med UPEC-stammer
Menneskelige nyreepitelceller (786-O eller HK-2) blev udsået i 24-well-plader, 24 timer før UPEC-infektioner. Til ADAM10-hæmning blev cellerne præ-inkuberet med ADAM10-hæmmeren GI254023X (Sigma-Aldrich) i 20 timer før infektioner. Cellerne blev inficeret med bakterier med den angivne multiplicitet af infektion (MOI) i 6 h eller stimuleret med de angivne koncentrationer af renset HlyA eller pro-HlyA i 12 h. I nogle eksperimenter blev cellerne behandlet med ∆hlyA (MOI 0.01) tilsat renset HlyA (75 nM) i 6 h. Til invasionsundersøgelse blev cellerne efter 6 h infektion vasket fem gange med PBS og behandlet med 200 μg/ml gentamicin i 1 h for at dræbe ekstracellulære bakterier. Cellerne blev derefter vasket to gange med PBS og lyseret med 500 μl 0,2 % triton X-100 i PBS og udplottet på LB-agarplader til optælling af de intracellulære bakterier.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
GM-CSF-niveauer i supernatanten fra inficerede 786-O-celler, HlyA/pro-HlyA-behandlede 786-O-celler eller homogeniserede nyrer efter infektion blev målt ved hjælp af et ELISA-udviklingssæt (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, Kina) i henhold til producentens instruktioner. Musenyrerne blev fjernet og homogeniseret i PBS indeholdende 1 % Triton X-100 og komplette mini-EDTA-fri proteaseinhibitorcocktailtabletter (11697498001, Roche, Indianapolis, IN). Homogenaterne blev derefter inkuberet på is i 30 min. og centrifugeret ved 10 000 × g i 10 min. ved 4 °C; supernatanterne blev opsamlet og anvendt til ELISA-analyse af GM-CSF, IL-1β, TNF-α, IL-6 og MIP-2 i henhold til producentens instruktion (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, Kina).
Cytotoksicitetsassays
Cellekulturovernatanter fra 786-O-celler, der blev behandlet med rensede proteiner eller dialysebuffer i 12 timer, blev indsamlet og detekteret for laktatdehydrogenase (LDH) ved hjælp af et CytoTox-96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit (G1780, Promega, Madison, WI, USA).
Urinprøver fra patienter
Urinprøver blev indsamlet fra patienter, der var inficeret med UPEC-stammer, der blev behandlet på Second Hospital of Tianjin Medical University, og tilstedeværelsen af hlyA-genet i UPEC-stammen isoleret fra urinen hos den enkelte patient blev bestemt ved PCR (Supplerende tabeller S2 og S4). Urinen blev koncentreret til 200 μl ved hjælp af Amicon Ultra-15 Centrifugalfilterenheder (UFC901024, Millipore), og derefter blev den koncentrerede væske påvist ved hjælp af ELISA-udviklingssæt (Neobioscience Technology Company). Undersøgelserne i forbindelse med patientprøver blev godkendt af den etiske komité ved Tianjin Medical University, og der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle patienterne.
RNA-udtrækning og qRT-PCR
786-O-celler blev inficeret med CFT073, ∆hlyA eller ∆hlyA p-hlyA (MOI 0,01) i 4 h. RNA blev ekstraheret ved hjælp af et Total RNA Extraction Kit (Solarbio, Beijing, Kina) i henhold til producentens protokol og omvendt transskriberet ved hjælp af RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific). qRT-PCR blev udført ved hjælp af en FastStart Universal SYBR Green Master mix (Roche, Basel, Schweiz) på et 7900 Fast Real-Time PCR System (Roche). PCR-cyklusbetingelserne var 95 °C i 5 min, efterfulgt af 40 cyklusser på 95 °C i 20 s, 60 °C i 20 s og 72 °C i 20 s. β-actin blev anvendt som endogen kontrol, og data blev normaliseret på grundlag af transkriptionsniveauet af β-actin i vildtypen og kvantificeret ved hjælp af den komparative kritiske tærskelcyklus 2-∆∆∆Ct-metode. De anvendte primere er anført i Supplerende tabel S4.
Khemotaxisassays
Cellemigrationsassays blev udført ved hjælp af Transwell-kamre (porestørrelse 5 μm, Costar, Corning 3421, Corning, NY, USA). THP-1-celler (2 × 106 i 200 μl) blev re-suspenderet i serumfrit RPMI 1640-medium og tilsat til det øverste kammer. Supernatant fra inficerede 786-O-celler blev blandet med 1 μg/ml neutraliserende antistof mod humant GM-CSF (502203, BVD2-23B6, Biolegend) eller kontrol IgG2a (400515, Rat IgG2a, Biolegend) og inkuberet i 30 minutter. Derefter blev 600 μl medium indeholdende supernatanten tilsat til det nederste kammer som kemoattraktivt middel. Efter 3 h eller 6 h inkubation ved 37 °C i en fugtet atmosfære med 5 % CO2 blev de migrerede celler i det nederste kammer talt.
Clodronatliposomer og anti-GM-CSF antistofbehandling
For at eliminere makrofager blev 200 µl PBS eller clodronatliposomer indgivet til musene intravenøst 24 timer før infektion.32,33 For at neutralisere GM-CSF blev neutraliserende antistof mod GM-CSF (505408, MP1-22E9, Biolegend, 250 µg) eller kontrol IgG2a (400533, Rat IgG2a, Biolegend, 250 µg) injiceret intravenøst til musene 1 time før infektion.33,58
Antistoffer og western blotting
Antistoffer blev opnået fra følgende firmaer: monoklonalt anti-FLAG-antistof (F1804, Sigma-Aldrich), anti-MYC-Tag-antistof (66004-I-Ig, Proteintech, Chicago, IL, USA) og anti-Nectin-2 antistof (ab135246, Abcam, Cambridge, UK). Helcellelysater blev fremstillet ved hjælp af RIPA-lysisbuffer (Millipore) med komplette proteaseinhibitorer (Roche, Basel, Schweiz). BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher) blev anvendt til bestemmelse af proteinkoncentrationen. HRP-konjugeret anti-kanin-IgG (1:10000, Sigma-Aldrich) eller anti-mus-IgG (1:10000, Sigma-Aldrich) blev anvendt til at afsløre antistofbinding. Immunoreaktive komplekser blev detekteret ved hjælp af Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrat (Millipore) og eksponeret på en GE Amersham Imager 600 maskine.
Far-western blotting og LC-MS/MS-analyse
Far-western blotting-protokollen blev udført som tidligere beskrevet.59 786-O-celler blev vasket to gange med iskold PBS, og cellemembranproteinerne blev isoleret ved hjælp af et membran- og cytosolproteinekstraktionssæt (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kina) i henhold til producentens protokol. Opløselige membranassocierede proteiner blev analyseret ved hjælp af natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese på 10%-geler. Proteinerne blev derefter overført til polyvinylidenfluorid (PVDF)-membran (Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland). De overførte proteiner blev renatureret ved hjælp af AC-buffer ved gradvis at reducere guanidin-HCl-koncentrationen.59 Derefter blev membranen blokeret med 5 % skummetmælk i TBST-buffer i 1 time. Herefter blev membranen inkuberet med 30 μg/ml oprenset FLAG-tagged HlyA eller dialysebuffer natten over ved 4 °C. Efter vask blev membranen inkuberet med 1:1000 fortyndet anti-FLAG-antistof (Sigma-Aldrich) natten over ved 4 °C i 5 % skummetmælk i TBST-buffer. Derefter blev membranen vasket grundigt og inkuberet med HRP-konjugeret anti-mus IgG (1:10000, Sigma-Aldrich)
De differentielle bånd mellem dialysebuffergruppen og FLAG-tagged HlyA-gruppen blev identificeret ved hjælp af LC-MS/MS, der blev udført ved hjælp af et nanoLC-LTQ-Orbitrap XL-massespektrometer (Thermo, San Jose, CA, USA) koblet med et Eksigent nano LC 1D plus HPLC-system i Majorbio (Shanghai, Kina). Tryptiske peptider blev fuldt enzymatisk fordøjet og ioniseret ved hjælp af nano elektrospray-ionisering.33 Data blev analyseret ved hjælp af et massespektrum med fuld scanning (300 til 1800 m/z). Endelig blev Proteome Discoverer (version 1.4.0.288, Thermo Scientific) anvendt til at analysere MS-dataene.
RNA-interferens og Nectin-2 overekspression
Small-interfering RNA’er (siRNA’er) for de målrettede gener og et scrambled kontrol siRNA (siScr) blev syntetiseret af GenePharma (Shanghai, Kina). SiRNA’erne blev transficeret i 786-O- eller HK-2-celler ved hjælp af Lipofectamine 3000 (Invitrogen). pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 blev transficeret i 786-O- eller HK-2-celler ved hjælp af Lipofectamine 3000 (Invitrogen) for at overeksprimere Nectin-2. 48 timer efter transfektion blev cellerne analyseret for proteinekspression ved hjælp af Western Blotting. Sekvenserne af siRNA’erne er anført i Supplementary Table S4.
Immunoprecipitation
293T-celler blev transficeret med pLenti-Hygro-vektoren eller pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2, og derefter dyrket i 48 timer. Cellerne blev derefter inkuberet med FLAG-mærkede HlyA (75 nM) i 6 h efter transfektion og blev nyligt lyseret i lysisbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 % NP-40, 0,2 mM EDTA, 150 mM NaCl) til western blotting eller immunoprecipitations (IP)-assays. 786-O-celler blev inkuberet med FLAG-mærket HlyA (75 nM) eller dialysebuffer i 6 timer og derefter lyseret ved hjælp af lysisbuffer til protein-IP-assay. Celleovernatanter blev inkuberet med anti-FLAG M2 perler (A2220, Sigma-Aldrich) eller anti-Myc M2 perler (A7470, Sigma-Aldrich) i 12 timer ved 4 °C for FLAG-tagget eller Myc-tagget protein IP. Til Nectin-2-protein-IP blev cellesupernatanterne inkuberet med anti-Nectin-2 antistof (ab135246, Abcam) i 12 timer ved 4 °C og derefter inkuberet med Protein A/G agarose (20241, Thermo Fisher) i 2 timer ved 4 °C. Normal kanin-IgG (2729S, CST) blev anvendt som kontrol. Efter inkubation blev udfældningerne opsamlet ved centrifugering, vasket fem gange med lysisbuffer og analyseret ved immunoblotting med monoklonalt anti-FLAG-antistof, anti-MYC-Tag-antistof eller anti-Nectin-2-antistof.
Bakterielt udtrykt, oprenset rekombinant FLAG-mærket HlyA (1 µg) blev inkuberet med 1 μg bakterielt udtrykt oprenset rekombinant Nectin-2 i bindingsbuffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,1 % Triton-X 100, 100 mM NaCl, 20 % glycerin,1 % BSA) i 12 h. Komplekserne blev derefter underkastet FLAG-mærket protein-IP eller Nectin-2 protein-IP. Endelig blev de komplekse proteiner analyseret ved hjælp af immunoblotting.
Statistisk analyse
Den statistiske signifikans af forskellene mellem grupperne blev testet ved hjælp af analyse af varians (ANOVA) analyse. Den ikke-parametriske Mann-Whitney-test blev anvendt til at beregne den statistiske signifikans i in vivo-eksperimenterne.