Afbildning af nerveaktivitet i den ventrale nervekæde hos voksne Drosophila

Drosophila-linjer

Flere linjer (GMR57C10-Gal4, elav-Gal4, UAS-GCaMP6s, UAS-GCaMP6f, UAS-CD4:tdGFP, og UAS-tdTomato) blev opnået fra Bloomington Stock Center. MAN-Gal4 (VT50660-AD; VT14014-DBD) og MDN-1-Gal4 (VT44845-DBD; VT50660-AD) blev stillet til rådighed af B. Dickson (Janelia Research Campus). DNa01-Gal4 (SS00731: GMR22C05-AD; GMR56G08-DBD), DNb06-Gal4 (SS02631: GMR20C04-AD; BJD113E03-DBD), DNg13-Gal4 (SS02538: BJD118A10-AD; BJD123E03-DBD), og DNg16-Gal4 (SS01543: BJD104A07-AD; BJD107F12-DBD) blev stillet til rådighed af G. Rubin (Janelia Research Campus).

Generering af Act88F:Rpr-konstrukt og fluer

Actin88F:Rpr-stammer (Act88F:Rpr-fluer) blev genereret ved hjælp af et Actin88F:eGFP-konstrukt29. Act88F:GFP-linjen, som indeholder et eGFP-konstrukt drevet af en 2053 bp-region af actin88F-promotoren, blev opnået fra R. Benton (Lausanne Universitet). En Act88F:Rpr-konstruktion blev genereret ved først at bruge følgende primerpar til at tilføje et KpnI-restriktionssted til 5′-enden af en rpr-cDNA-klon (IP02530, Drosophila Genomics Resource Center, Bloomington, IN) og et XbaI-sted til 3′-enden af den åbne læseramme via et QuikChange Site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies):

Forward primer 5′ AGACGGTACCATATGGCAGTGGCATTC 3′

Reverse primer 5′ GCCGCGTCTCTAGATATCATTGCGATGGCTT 3′

Rpr-konstruktionen blev derefter splejset ind i Act88F:eGFP-konstruktionen bag Act88F-promotoren i stedet for eGFP-sekvensen. Act88F:Rpr-konstruktionen blev injiceret i attp18 Drosophila-embryoner til PhiC31 integrase-medieret stedsspecifik transgenese35 (transgenlandingssted cytolokalisering 6C12) af BestGene Inc. (Chino Hills, CA). I nogle forsøg blev dette transgen kombineret med UAS-GCaMP6s-p2A-tdTomato (genereret i M.H.D.’s laboratorium).

Fluorescensafbildning af indirekte flyvemuskler

Fluorescensmikroskopi af hemi-thoraces blev udført36,37. Kort fortalt blev fluerne bedøvet, og deres hoved og bagkrop blev derefter fjernet. Thoraces blev fikseret natten over i 4% paraformaldehyd ved 4 °C og skyllet i 1× fosfatbufferet saltvand (PBS) den følgende dag. Prøverne blev anbragt på et objektglas, frosset ned i flydende nitrogen og halveret i midsagittalplanet med et barberblad. IFM’er blev farvet med Alexa-Fluor 568 Phalloidin (1:100 i PBS med 0,1 % Triton-X (PBST)) natten over ved 4 °C, skyllet med PBS og visualiseret ved hjælp af EVOS® FL Cell Imaging System (Life Technologies) ved ×4 forstørrelse. Til helmontering af IFM-myofibriller blev fluerne forberedt, og thoracerne blev halveret som beskrevet ovenfor. Hemi-thoraces blev farvet med Alexa-Fluor 568 Phalloidin (1:100 i PBST) natten over ved 4 °C. Prøverne blev skyllet i PBS, monteret med Vectashield (Vector Laboratories) og visualiseret ved hjælp af et Leica TCS SPE RGBV konfokalt mikroskop (Leica Microsystems) ved 100x forstørrelse.

Immunofluorescensafbildning af hjerner og ventrale nervebånd

Hjerner og VNC’er blev dissekeret ud af 2-3 dpe hunfluer i PBS. Vævene blev derefter fikseret i 20 min. i 4 % paraformaldehyd i PBS ved stuetemperatur i 4 % paraformaldehyd. Efter fiksering blev hjerner og VNC’er vasket 2-3 gange i PBS med 1 % Triton-X-100 (PBST) i 10 min hver og derefter inkuberet ved 4 °C natten over i PBST. Prøverne blev derefter anbragt i PBST med 5 % normalt gedeserum (PBSTS) i 20 min. ved stuetemperatur. De blev derefter inkuberet med primære antistoffer (kanin anti-GFP i 1:500, Thermofisher RRID: AB_2536526; mus anti-Bruchpilot/nc82 i 1:20, Developmental Studies Hybridoma Bank RRID: AB_2314866) fortyndet i PBSTS i 48 timer ved 4 °C. Hjerner og VNC’er blev skyllet 2-3 gange i PBST i 10 min. hver, inden de blev inkuberet med sekundære antistoffer (sekundært anti-kanin-anti-kanin-antistof af gedekonjugeret med Alexa 488 i 1:500; Thermofisher; sekundært anti-mus-antistof af gedekonjugeret med Alexa 633 i 1:500; Thermofisher) fortyndet i PBSTS i 48 timer ved 4 °C. Endelig blev hjerner og VNC’er skyllet 2-3 gange i 10 min hver i PBST og monteret på objektglas med brodæksglas i Slowfade-monteringsmedie (Thermofisher).

Proverne blev afbilledet ved hjælp af et Carl Zeiss LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope med følgende indstillinger: ×Det er en af de mest effektive metoder til at opnå en god kvalitet og en god kvalitet. Der blev foretaget z-projektioner med standardafvigelse af billedvolumen ved hjælp af Fiji38. For at sammenligne GFP-ekspression i centralnervesystemet blev laserintensiteten og PMT-forstærkningerne for den grønne kanal holdt konstante på tværs af wild-type-, A1 > GFP- og Act88F:GFP-prøver.

Imaging GFP-ekspression i benmuskler

Legs blev manuelt dissekeret ved kroppen-coxa-leddet og monteret på glasobjekttråde ved hjælp af dobbeltklæbende tape. Slowfade-monteringsmedie (Thermofisher) blev derefter tilsat til mellemrummet mellem dækglasset og objektglasset. Derefter registrerede vi GFP-fluorescens i den grønne kanal ved hjælp af et LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope (Zeiss). Laserintensitet, PMT-forstærkninger og scanningsparametre blev holdt konstante på tværs af dyr af vild type, MHC > GFP og Act88F:GFP: GATT: ×20 forstørrelse, 8-bit dynamisk område, ×8 billedgennemsnit, 0,63 × 0,63 µm pixelstørrelse og 10 µm z-trinsinterval. Cuticular auto-fluorescens blev også registreret i den røde kanal.

Thorakal dissektion til VNC-billeddannelse

Specielt tilpassede holdere, der blev brugt til at montere fluer under billeddannelse, blev fremstillet som tidligere beskrevet39. Til VNC-billeddannelse blev disse stadier ændret til at have (i) flade i stedet for foldede stålskiver og (ii) affasede hjørner for at gøre det sfæriske løbebånd synligt for optiske strømningssensorer (Shapeways, ‘file’). Stålskiverne blev fremstillet af 0,001″ rustfrit stål, type 316 blødt udglødet (McMaster-Carr, del nr. 2317K11). Skinnepladerne blev ætset (Etchit, Buffalo, MN) for at skabe rektangulære huller som forklaret “her”. Shim-designfilen kan findes ‘her’.

Alle eksperimenter blev udført på 1-3 dpe hunfluer, der blev opdrættet ved 25 °C på standard majsmelfoder ved en 12 timers lys:12 timers mørkecyklus. Fluerne blev bedøvet ved 4 °C. Der blev udvalgt en hunflue, og i nogle tilfælde blev dens vinger klippet af for at forenkle monteringen. Fluens dorsale thorax blev derefter skubbet gennem et hul i billeddannelsestrinets stålskinne. Derefter blev scenen vendt, UV-hærdende lim (Bondic, Aurora, ON Canada) blev omhyggeligt påført rundt om brystkassen og hærdet ved UV-belysning (LED-200, Electro-Lite Co. Bethel, CT, USA). UV-lim blev derefter brugt til at fastgøre hovedet og bugen på undersiden af scenen. Derefter blev scenen fyldt med ekstracellulær saltvand18. Under et dissektionsmikroskop med høj forstørrelse (Leica M165C) blev en injektionsnål (30 G, BD PrecisionGlide, Franklin Lakes, NJ, USA) brugt til at skære og løfte kutikulaen af den dorsale thorax40 , idet man var forsigtig med ikke at skære nakkeforbindelsen over. Efterfølgende blev der i ikke-Act88F:Rpr-dyr anvendt en sløv tang til at fjerne IFM’er, fortrinsvis fra den anterior-mediale region af thorax, der ligger over tarmen (dette trin er unødvendigt i Act88F:Rpr-dyr). Denne proces blotlægger den dorsale overflade af proventriculus – en stor pæreformet tarmstruktur. Med stor forsigtighed blev der derefter brugt en superfin pincet til at gribe fat i og løfte proventriculus for at flytte en stor del af tarmen (herunder afgrøden og spytkirtlerne) fra det mere ventralt beliggende nervevæv. Da tarmen således var hævet, blev der brugt en ultrafine klippesaks (Fine Science Tools, Foster City, CA, USA) til at skære den over i den forreste del af tarmen. Proventriculus blev derefter skrællet tilbage, og der blev foretaget et bagudvendt snit for at fjerne disse dele af tarmen fuldstændigt og afsløre det underliggende nervevæv. Det er bemærkelsesværdigt, at denne dissektion også fjerner aorta, hvilket begrænser hæmolymphestrømmen fra det abdominale dorsale kar. Ikke desto mindre fandt vi, at fluerne var levedygtige og opførte sig i op til 4 timer. I nogle tilfælde observerede vi, at tarm- eller muskelvæv begyndte at skjule VNC under billeddannelsen. Derfor bør løst væv fjernes på dette tidspunkt, idet man skal være meget omhyggelig med ikke at afskære VNC’en. Efter hver dissektion undersøgte vi, i hvilket omfang dyret bevægede benene som reaktion på et luftpust eller greb fat i en genstand med hvert af benene. Dette viste sig at være en præcis indikator for præparationens succes. For at vurdere kvaliteten af en dissektion undersøgte vi bevægelserne af hvert ben på det sfæriske løbebånd. Hvis en flue kunne gå på en koordineret måde, blev dissektionen anset for at være vellykket. I modsat fald blev dyret kategoriseret som havende en mangel på bevægelser af lemmer. Dyr med flere dysfunktionelle ben blev kategoriseret som uarbejdsdygtige.

2-fotonmikroskopi under adfærd

Experimenter blev udført om aftenen Zeitgeber tid (Z.T.), og dyrene blev typisk afbilledet 30-60 min efter dissektion. Flueholdere blev fastgjort til en hævet platform over det sfæriske løbebånd (Supplerende fig. 3a). VNC blev derefter lokaliseret ved hjælp af mikroskopokulærer og placeret i midten af synsfeltet ved 2-photon billeddannelse.

Det sfæriske løbebånd er en aluminiumsstang med et kugleformet hul fræset i den ene ende22. Vi fremstillede skumkugler med en diameter på 10 mm (Last-A-Foam FR-7106, General Plastics, Burlington Way, WA USA) og plettede dem manuelt ved hjælp af en Rapidograph-pen (Koh-I-Noor, Leeds, MA USA) for at give højkontrasttræk til optiske flowmålinger. En strøm på 500-600 mL min-1 af filtreret og befugtet luft blev ført gennem holderen ved hjælp af en digital strømningsregulator (Sierra Instruments, Monterey, CA, USA). Kuglens bevægelser blev målt ved hjælp af to optiske flowsensorer (ADNS3080) udstyret med zoomobjektiver (Computar MLM3X-MP, Cary, NC, USA). Kuglen og fluen blev belyst ved hjælp af et par IR-LED’er (850 nm bølgelængde) koblet til optiske fibre og kollimatorlinser (ThorLabs, Newton, NJ, USA). Optiske flowmålinger blev sendt til et mikrocontrollerboard (Arduino Mega2560), som blev registreret ved hjælp af brugerdefineret Python-kode. Samtidig blev der foretaget videooptagelser af dyrenes adfærd på bolden ved hjælp af et IR-følsomt firewire-kamera (Basler, Ahrensburg, Tyskland) med ca. 30 billeder pr. sekund (fps).

Vi udførte 2-photonmikroskopi ved hjælp af et Bergamo II-mikroskop (ThorLabs) udstyret med to GaAsP PMT-detektorer til GCaMP6- og tdTomato-billeddannelse og koblet til en Ti:Sapphire-laser (MaiTai DeepSee, Newport Spectra-Physics, Santa Clara, CA USA) afstemt til 930 nm. Der blev anvendt et Olympus 20× vandindblændingsobjektiv med 1,0 NA (Olympus, Center Valley, PA, USA). Mikroskopet blev styret ved hjælp af ThorImage-software (ThorLabs). Eksperimenter med koronale snitbilleder blev udført i Galvo-Galvo-billeddannelsestilstand ved 6-9 Hz. Denne billedfrekvens varierede med billedstørrelsen, som lå mellem 26,58 × 26,58 µm og 53,15 × 53,15 µm. Lasereffekten varierede mellem 3 mW og 5,7 mW. Volumetrisk billeddannelse er også mulig med passende hardware (f.eks. galvo-resonansscanner og piezo-drevet objektivkrave).

Af og til blev der brugt et pust af luft for at fremkalde gangadfærd. Disse pust blev digitalt kodet (Honeywell AWM 3300 V, Morris Plains, NJ USA). Tilpasset ROS-software, der via en analog udgangsenhed (Phidgets, Calgary, Canada) var forbundet med ThorSync-software (ThorLabs), blev anvendt til at synkronisere optiske flowmålinger, adfærdsvideografi, luftpuffmålinger og 2-photon-billedindsamling. Til koronale snitbilleder blev der anvendt en piezokrave (Physik Instrumente, Karlsruhe, Tyskland) til at styre mikroskopobjektivets hurtige z-aksebevægelser.

For at sammenligne den neurale aktivitet mellem kontrol- og Act88F:Rpr-dyr erhvervede vi 512 × 512 pixelbilleder med 1,7 fps ved hjælp af en konstant laserintensitet og PMT-forstærkning. Udvalgte billeddannelsesregioner blev empirisk valgt som horisontale sektioner bestående af landemærker observeret i ~ 61-65 µm dybde i Supplerende film 1.

Sammenligning af gang med eller uden dissektion

For at evaluere virkningerne af dissektion på lokomotion blev vild-type dyr underkastet følgende procedure. Dyrene blev monteret på billeddannende stadier, og der blev tilsat saltvand til hvert stadium. Kun en tilfældig delmængde af dyrene blev dissekeret. Hver monteret flue blev derefter anbragt på det sfæriske løbebånd, og dens gangadfærd blev registreret i 30 minutter. Den optiske strøm blev registreret som beskrevet ovenfor. For at øge sandsynligheden for lokomotion blev en 500 ms puls af 100% CO2 rettet mod fluens antenner med et interval på 1 min mellem impulserne (0,05 ln min-1 ved hjælp af en masseflowcontroller; Vögtlin Instruments, Schweiz).

Infrarød laser antennestimulering

For at sammenligne gangadfærd mellem Act88F:Rpr og kontroldyr stimulerede vi deres antenner med en 830 nm nærinfrarød laser (Schäfter + Kirchhoff, Tyskland). Vi bedøvede først 7-8 dpe hundyr ved 4 ° C og monterede dem på billeddannelsesstadier. Fluerne blev derefter akklimatiseret i 10 minutter. For hvert forsøg modtog et dyr ti 2 s laserstimuleringsimpulser (18,1 mW) til dets højre antenne med 60 s interval mellem impulserne. Kontrol- og Act88F:Rpr-dyr blev testet skiftevis for at minimere virkningerne af cirkadisk tid på adfærdsmæssige sammenligninger.

Statistik

Stikprøvestørrelser for dyreeksperimenter blev valgt som følger: Vi udførte mindst tre eksperimenter for at illustrere populations- og sparsomme neurale optagelser og udførte mere end ti eksperimenter pr. Gruppe, når vi udførte statistiske sammenligninger. Et på forhånd opstillet kriterium om lavt signal/støjfluorescenssignaler resulterede i fjernelse af to MDN-eksperimenter fra vores datasæt. Der blev ikke anvendt randomisering eller blinding. For antennel laserstimulering var dataene ikke normalfordelte, og derfor blev Friedman- og Mann-Whitney U-tests udført. Estimater af variation er præsenteret som gennemsnit og bootstrapped 95% konfidensintervaller.

Dataanalyse

Vi analyserede alle data ved hjælp af brugerdefinerede Python-scripts. Da dataindsamlingsfrekvensen var forskellig for optisk flow, adfærdsvideografi og 2-photon-billeddannelse, interpolerede vi signalerne for at matche dem med den højeste frekvens. Efterfølgende blev optiske flowdata udglattet ved hjælp af et løbende gennemsnit (vindue = 200 ms) og derefter oversat til rotationer s-1 for anterior-posterior, medial-lateral og yaw-akser22. For at gøre disse målinger mere intuitive blev rotationer s-1 derefter konverteret til mm s-1 (1 rot s-1 = 31,42 mm s-1) for anterior-posterior (vforward) og medial-lateral (vside) bevægelser og til grader s-1 (1 rot s-1 = 360° s-1) for yaw (vrotation) bevægelser22.

Analysen af lokomotion i dissekerede dyr (Supplerende fig. 2) blev udført på følgende måde. Vforward optiske flowdata for 20 dissekerede og 20 ikke-dissekerede fluer blev downsamplet til 1500 punkter s-1 og udglattet ved hjælp af et løbende gennemsnit af varighed 0.2 s. For at beregne procentdelen af tiden med at gå fremad/bagud eller sidelæns blev der empirisk defineret to tærskelværdier, -0,31 mm s-1 og +0,31 mm s-1 , for at skelne mellem at stå stille og henholdsvis gå fremad (mod højre) eller bagud (mod venstre). Værdier over 0,31 mm s-1 blev betragtet som øjeblikke af fremadgående (højreorienteret) gang, og værdier under -0,31 mm s-1 blev betragtet som øjeblikke af baglæns (venstreorienteret) gang. Optiske flowværdier mellem disse tærskelværdier blev betragtet som øjeblikke, hvor man stod stille. Procentdelen af tiden med gang blev beregnet som andelen af datapunkter, hvor et dyr ikke blev anset for at stå stille. På samme måde blev tærskelværdier på 10,8 og -10,8 grader s-1 anvendt til at definere øjeblikke med drejning. Et anfald blev defineret som en kontinuerlig periode med gang eller drejning.

Store vævsdeformationer kunne forekomme under adfærd. Derfor udførte vi post-hoc pan-neuronal billedregistrering (Fig. 2). Vi registrerede alle rammer af et billedeksperiment til et referencebillede. Da kompleksiteten af deformationer ikke kunne indfanges ved hjælp af simple parametriske bevægelsesmodeller (f.eks. affine transformationer), brugte vi en ikke-parametrisk, variational tilgang, der er designet til at modellere vilkårligt komplekse deformationer. Vi beregnede bevægelsesfeltet w mellem referencebilledet, betegnet Ir, og billedet på tidspunktet t, betegnet It, ved at løse minimeringsproblemet

hvor D(w) er et term til tilpasning af data, det andet udtryk er en regulering, der fremmer glatheden af w ved at straffe gradienten ∇w41, Ω er det diskrete billeddomæne, og parameteren λ afbalancerer bidragene fra de to udtryk.

GCaMP6s-billeder udgør en udfordring for bevægelsesestimation, fordi neural aktivitet producerer store lokale intensitetsændringer. Derfor anvendte vi en yderligere aktivitetsuafhængig fluorofore, tdTomato, og definerede et dataterm af formen

Den første term modellerer standardantagelsen om bevarelse af intensiteten langs hver pixels bane. Det er defineret ved

hvor vi bruger en \(\ell _1\)-norm for at opnå delvis robusthed over for intensitetsændringer42. Det andet udtryk i Eq. (2) er en egenskabstilpasningsbegrænsning inspireret af Revaud og medarbejdere43 , skrevet som

I ligningerne (2)-(4) er Ir og It fra tdTomato-kanalen. Minimering af funktionen ϕ favoriserer bevægelsesvektorer w(x) til at ligge tæt på funktionskorrespondancer m(x, Ir, It), beregnet på et sparsomt sæt af relevante nøglepunkter. Vi opnår m ved hjælp af den feature matching-algoritme, der er foreslået af Revaud og medarbejdere43 , og som er specielt designet til at håndtere store billeddeformationer. Vi beregner m ved hjælp af tdTomato-billeddannelseskanalen, således at korrespondancerne også er ufølsomme over for intensitetsændringer mellem Ir og It. Som følge heraf styres estimeringen af pålidelige matchninger af funktioner. Parameteren γ afbalancerer de to termer i Eq. (2).

For hvert eksperiment optimerede vi værdierne for λ og γ ved hjælp af en gitter søgning for at registrere horisontale snitbilleder af VNC (Supplerende figur 4). Som målfunktion for optimering anvendte vi gradienten af det tidsmæssige middelbillede44. Små værdier af λ (dvs. λ < 1000), førte lejlighedsvis til artefakter i de registrerede billeder. Disse artefakter var forbundet med stærk konvergens i vektorfeltet w(x) (Supplerende fig. 4c). Derfor definerede vi empirisk artefakter som klynger af pixels med \({\mathrm{div}}}\\,{\mathbf{w}}}\left( {\mathbf{x}}} \right) < – 1,2\) og kardinalitet >20 (vi opnåede lignende resultater med kardinalitet >5). Endelig valgte vi λ- og γ-værdierne som de værdier uden artefakter og med den højeste gradient af middelbilledet. Eksempler på uregistrerede billeder, transformationsvektorfelter og registrerede billeder af de tre optimerede eksempler er vist i Supplementary Movie 5.

Vi løste optimeringsproblemet i Eq. (1) med en ADMM-algoritme (Alternated Direction Method of Multiplier)45. Vi indførte to opdelingsvariabler, der er forbundet med henholdsvis reguleringstermerne og funktionalitetstilpasningstermerne. Hvert delproblem i algoritmen blev løst analytisk. Vi brugte dele af biblioteket til inverse problemer, der er beskrevet i ref. 46. Der blev anvendt en efterbehandling baseret på vægtet medianfiltrering ved hjælp af metoden fra47.

I fig. 2 blev adfærden halvautomatisk annoteret ved hjælp af et brugerdefineret Python-modul. Dette modul giver brugeren mulighed for at vælge to regioner af interesse (ROI’er) på videoens første billede. Den første ROI anvendes til at registrere gang og skal placeres over de metathorakale og mesothorakale ben. Den anden ROI er ansvarlig for at registrere prothoracal benpleje og skal placeres foran fluen. For at detektere bevægelse i disse områder trækkes de på hinanden følgende billeder fra. De resulterende differentialbilleder er derefter medianudvisket (radius = 5 pixels) for at reducere støjen. På grundlag af dette slørede billede anvendes en tærskel for antallet af ikke-nul-pixels i hver af de to ROI’er for at udtrække binære sekvenser af pudse- og gåture. Det skal bemærkes, at der ikke tages hensyn til de prothoracale benbevægelser, der observeres under gang (dvs. at klassifikationen af pudsning er underordnet klassifikationen af gang). Der blev derefter anvendt et hysteresefilter til at lavpasfiltrere binære adfærdssekvenser og til at fjerne overgange, der forekommer over for få billeder til at være biologisk plausible. Eksempler på ROI’er og adfærdsmæssige annotationer er illustreret i tillægsfilm 6. Disse adfærdsdata blev anvendt i fig. 2 som vist i supplerende film 2. De blev annoteret ved hjælp af følgende parametre: tærskel for gang = 400, tærskel for grooming = 5, hystereselængde for gang = 8, hystereselængde for grooming = 10.

For Fig. 2b, c, brugte vi lineær regression til at finde regioner i VNC, der er forbundet med enten gang eller grooming. Regressorer Xw og Xg (for henholdsvis gang og grooming) blev konstrueret ud fra de to adfærdssekvenser, Sw og Sg, ved hjælp af Eq. (5) ved konvolution med et eksponentielt faldende Calcium-signalimpulsrespons (CIR) afledt af tidskonstanten målt for GCaMP6s (t½ = 1.1448 s)19.