Tre-dimensionel rekonstruktion af ædeapparatet hos flåten Ixodes ricinus (Acari: Ixodidae): et nyt indblik i mekanismen for blodspisning

Røntgenbilleder af hunkønnet I. ricinus

Her viser vi, at røntgen CRYTUR-opstillingen (baseret på X-RayWorx mikrofokus, røntgenkilde og CRYCAM-røntgendetektor) er særdeles velegnet til hurtig og ikke-destruktiv observation af osmiumimprægnerede indre strukturer hos hunflåter. Figur 1A viser cheliceral retractor-muskler, der strækker sig til området omkring det andet benpar, tykkelsen af kutikula, musklerne i benene og palperne (fig. 1A, film 1). Den 3D-model, der er opnået ved hjælp af 2D-røntgenprojektionsbilleder, gav yderligere rumlige oplysninger om de overfladiske strukturer i hunkapellet (fig. 1B), der kan sammenlignes med den forudgående afbildning ved SEM (fig. 1D) med mulighed for også at visualisere visse indre strukturer (f.eks. muskler, chelicerabaser og svælg) på forskellige virtuelle skiver (fig. 1B). Røntgentomografiens opløsning var 8,060 µm og blev beregnet på grundlag af Fourier-analyse fra et rekonstrueret virtuelt snit i den laterale flade, der findes i midten af det rekonstruerede objekt. Vi konstruerede en graf af det radialt midlede effektspektrum, og på grundlag af Rayleigh-kriteriet vurderer vi adskillelse grænsesignal fra støj ved 8,94 % af afstanden mellem støjgulvet og topværdien. Da røntgenmodellen blev rekonstrueret ud fra projektionsbillederne i området fra 0° til 180° med et trin på 10°, er opløsningen teknisk set næsten isotropisk. Denne opløsning var imidlertid ikke tilstrækkelig til at observere nymfernes munddele (fig. 1C,D, se sammenligning af både hunnens og nymfernes munddele i samme forstørrelse).

Seriesnit SEM

Den 3D-model af fødeapparatet hos I. ricinus nymfe, der blev rekonstrueret ud fra serielle ultratynde harpikssnit, afslørede forholdet mellem spyt og fødekanal til capitulære styleter (chelicerae, hypostom) og andre tilknyttede strukturer, hovedsageligt muskler (Fig. 2, Film 2 og 3)14.

Udvendigt fra capitulum udstødes/suges spyt og blodmel ind i en smal slids, den præorale kanal, der er dannet mellem hypostomets rille på ventral side og chelicererne på dorsal side (fig. 2A). Hos Rhipicephalus (tidligere Boophilus) microplus ligger der en tynd membran, også kaldet renden, over den hypostomale rille12. Det er interessant, at denne struktur manglede hos Ixodes hexagonus9, Haemaphysalis longicornus15 og I. ricinus. Inde i capitulum fortsætter spyt/blodet ind i salivarium-hulen, og denne fælles vej afsluttes med en adskillelse af en fødekanal fra salivarium (Fig. 2A,B). Set fra rygsiden af tægen er fødekanalen placeret under spytkammeret. Spytkammeret er ikke en permanent fast struktur; det er snarere skabt ved at placere chelicererne over hypostomets dorsalside. Fødekanalen adskilles fra den fælles vej ved at munde ud i svælget. Dens tag er først dannet af en lille lamel (Fig. 2B, grøn pil), der udvider sig til en kort stang i dybden af capitulum (Fig. 2C,I grøn) og fortsætter som en større sklerotiseret vingelignende plade (også kendt som alae) (Fig. 2E,I, grøn). Alle disse strukturer udgør tilsammen et labrum. I den nederste del af labrum er der en tandlignende proces, der støder op til svælgåbningen (Fig. 2C,E, sorte pile). Denne tandlignende struktur er beskrevet hos I. hexagonus, I. holocyclus og Rhipicephalus microplus9,12,16. Den tandlignende proces ser ud til at passe ind i en rille i svælgåbningen, og derfor formodes den at være en vigtig del af svælgklappen. Identificeringen af denne tandlignende proces som labrum er berettiget på grund af dens lighed med labrum hos argaside flåter, som også strækker sig fra svælgtaget ind i fødekanalen13,16. Den anatomiske struktur af fødekanalen, det lille labrum og ventilen hos I. ricinus er i overensstemmelse med den langsomme fødeproces hos disse flåter, hvor lange sugepulser veksler med pulsen af spytsekretion i løbet af deres lange periode med blodfodring. Hos de bløde flåter strækker labrum sig imidlertid distalt langs hele fødekanalens længde. Dette stemmer overens med den hurtige fødeproces hos disse flåter, hvor den hurtige flagren af labrum er synkroniseret med hurtig sugning og spytdannelse, så de kan spise i løbet af kun 1-2 timer13. Baseret på vores EM-observationer var denne forreste del af svælgets tag ikke forbundet med muskler og udgør sandsynligvis en stationær (støttende) del af klappen (Fig. 2B). Rygtakket er forbundet med subhypostomiske plader, der danner siderne og et gulv i svælget (Fig. 2C hvide pile). Disse plader er forbundet med de store dilatationsmuskelbånd, der på deres modsatte sider er knyttet til den ventrale kutikula. De forreste dilatatormuskler i svælget (ADM, vist i fig. 2C, E, I som lyserødt farvede strukturer) er kun placeret i den forreste del af svælget, og deres sammentrækning/afspænding gør det muligt at åbne/lukke ventilen i svælgåbningen9,12. ADM er knyttet til det øverste hjørne og de dybeste laterale sider af den forreste del af svælget. Den midterste del af svælgets vægge er forbundet med en anden gruppe dilatationsmuskler, hvis sammentrækning udvider svælglumen til siden. Disse laterale dilatationsmuskler i svælget (LDM) kan ses i fig. 2G og som dybt rosa farvede strukturer i fig. 2I,J. LDM muliggør en massiv udvidelse af svælglumen, muligvis også på grund af den dobbelte Y-formede væg i den forreste del (fig. 2G) og den tredobbelte Y-formede væg i den bageste del af svælget i et tværsnit (fig. 2H), som er beskrevet af Arthur et al.9 og Sonenshine og Anderson13. Alternation af kontraktion og afslapning af begge dilatatormuskelgrupper udvider svælget synkront med åbningen af den forreste ventil, hvilket skaber en kraftig sugepuls. Afslapning af LDM efter lukning af den pharyngeale ventil presser pharynx sammen og driver det indtagne blod bagud ind i esophagus og midgut. Tidssynkronisering mellem åbning/lukning af svælgåbningen, koordineret med åbning og lukning af svælgventilen og komprimering/udvidelse af lumenet i den midterste del af svælget muliggør sugning samt bevægelse af føden ind i spiserøret og forhindrer også regurgitation af blodet tilbage i værten9,12. Den indre foring af svælget er sklerotiseret, mens spiserørsvæggen er beklædt med epitelceller (fig. 2A). Spiserøret passerer gennem synganglionet og går over i mellemtarmen (data ikke vist).

Salivariet er et stort hulrum beliggende mellem svælget og chelicerae (fig. 2A-E). Den forreste del af spytrummet er fælles for både blod- og spytpassage, hvorefter svælget er adskilt fra spytrummets bund af den lille lamel (se ovenfor). Salivariumets tag og sidesider er forstærket af den sklerotiserede cheliceralplade (ChP i Fig. 2C,E,F og den røde struktur vist i Fig. 2M), som strækker sig længere ind i tægekroppens hulrum. I den bageste del af spytkammeret er de laterale sider af denne plade forbundet med muskler, der er fastgjort i modsatte ender til de laterale sider af tæppens kropshule. Disse laterale spytmuskler (LMS) kan ses i fig. 2E, F, K, L markeret med lyslilla farve. Musklernes sammentrækning gør pladen flad, som er tæt forbundet med spytvæggen, hvilket fører til en indsnævring/lukning af spytrummets indre rum, dog kun i den bageste del bag svælgets adskillelse.

Dertil kommer, at gulvet i den bageste ende af spytbakken er forbundet med en lille skrå muskelgruppe (muskler, der er knyttet til spytbakkebunden, MS i fig. 2E,F,J,N, markeret med lyseblå), der er forbundet i de modsatte dele med den øverste del af den forreste del af svælget. Disse muskler muliggør en op- og nedadgående bevægelse af den bageste del af spytbunden. Disse muskler er blevet beskrevet hos hunnen af I. holocyclus16. Muligheden for, at spytbunden kan sænkes eller hæves, er tidligere blevet foreslået i forbindelse med hurtige spytudbrud på grundlag af en registrering af elektriske signaler under spytdannelse hos R. microplus og Dermacentor andersoni12,17,18,19,20. Under spytdannelse hos R. microplus blev der observeret hurtige (op til 30 pr. sek.) nedadgående afbøjninger i ledningsevnen efterfulgt af større spikes i slutningen af spytdannelsen. En forklaring på disse målinger er sammentrækninger af musklerne i den forreste del af svælget, ledsaget af en tilsvarende pulsering af membranen over fødekanalen (hypostomal gutter), der åbner en kanal til udledning af spyt20. Vi formoder, at de små skrå muskler, der er knyttet til spytbunden, kan generere vibrationer, der letter spytbevægelsen. Men også sidemuskler, der påvirker diameteren af spytrummets indre rum, kan medvirke til at uddrive spyttet ud af mundvigene (ikke medtaget i animationen). Vi foreslår, at chelicerernes bevægelse i værtshuden også kan være med til at udstøde spyt fra spytkammeret ind i værtshuden. Cheliceralbaserne (ChB i fig. 2A,B) er placeret direkte over spytbakken (set fra ryggen), og vi formoder, at disse strukturer lokalt kan komprimere spytbakken for at hjælpe med at udstøde spytet. Forlængelser af chelicerae, som var lidt asynkrone, blev observeret ved to-foton intra-vital mikroskopi direkte inden for fødestedet i hele perioden af I. scapularis-svækkelse21. Vi bemærkede, at chelicerae begynder at bevæge sig lidt asynkront efter påføring af pilocarpin på den dorsale kutikula på ufodrede og delvist fodrede hunner af I. ricinus (henholdsvis film 5 og 6). Cheliceralbaserne (ChB i Fig. 2A,B) er placeret direkte over spytbakken (set fra ryggen), og vi kan spekulere i, at disse strukturer kan udvide eller komprimere spytbakken og hjælpe med at udstøde spytet. Anvendelse af pilocarpin, et kolinergisk ikke-endogent lægemiddel, er velkendt for at fremkalde spytdannelse indirekte via tægenes centralnervesystem22 , mens dets virkning på andre væv i tægenes væv fortsat er uklar. Derfor kan vi ikke udelukke den pilocarpinmedierede bevægelse af chelicerae i vores eksperimenter som en yderligere virkning af dette lægemiddel hos flåter. Bockenstedt et al. foreslog, at chelicerae tvinger kollagenfibre tilbage, som kan komprimere fødestedet, hvilket i høj grad bekræfter vores hypoteser om chelicerae-medieret spytudstødning til værten21.

Kurtigt før enden af spythulen går der parvise spytkanaler ind i dens laterale hjørner12. Begge spytkanaler er omsluttet af et vævslag (TSD i fig. 2C,E,F,M,N, mørklilla), der sandsynligvis fleksibelt fastgør spytkanalerne til spytkassens laterale hjørner.

Simulering af spytdannelse og blodsugning baseret på 3D-modellen

Under fødesøgningsprocessen hos ixodide flåter veksler spytdannelsen med enten langsom eller hurtig blodsugning og kan omfatte en periode med hvile. Procentandelen af den tid, der bruges på hver aktivitet under hunnens syltning, er varierende og baseret på tidspunktet på dagen, størrelsen af flåter osv.18. I film 4 animerede vi både fødekanalen og kanalen til passage af spyt med tilhørende strukturer og viser, hvordan disse strukturer fungerer. Fødeprocessen hos de fleste ixodide flåter begynder med udskillelse af cementlignende stoffer, som gør det muligt for flåten at blive fastgjort i værtens hud og forsegler spalten mellem fødelæsionen og de indsatte munddele23,24,25. Salivationsperioden kan afsluttes med et kort udbrud af spyt16,17,18,19. Udstødningen af spyt er sandsynligvis lettere ved vibration af den bageste del af spytbunden; bevægelse af cheliceralbaserne kan også spille ind (film 6). Før blodsugningen begynder, indsnævres åbningen af den bageste del af spytbakken af de laterale muskler, der er spændt ud mellem spytbakketoppen og flåtkroppens sidevæg. Denne handling efterfølges af åbning af svælgklappen og en udvidelse af det forreste svælg forårsaget af sammentrækning af de forreste dilatatormuskler. Herefter strækkes den midterste del af svælget langs dets længdeakse, og blodet trækkes ind i svælget. Den forreste pharynxklap lukkes, inden pharynxvæggen kontraheres igen, og blodet skubbes bagud til spiserøret. Denne peristaltiske bølge gentages, indtil spytdannelsen begynder. I begyndelsen af spytdannelsen slapper de laterale begrænsningsmuskler i spytbakken af, hvorved spytbakkens hulrum udvides. Gentagne sænkninger og hævninger af spyttagets tag i dets bageste del letter sandsynligvis afgivelsen af spyt til den præorale kanal.