Syntese og antimikrobiel resistensmodulerende aktivitet af 2,4-dinitrophenylhydrazonderivater som midler mod nogle ESKAPE humane patogener

Abstract

Et bibliotek af seks nye phenylhydrazoner blev syntetiseret og evalueret for deres in vitro antimikrobielle og resistensmodulerende aktivitet mod et panel af Gram-positive, Gram-negative og svampearter. Forbindelserne blev fremstillet i gode udbytter på 60-92 % w/w og karakteriseret ved hjælp af smeltepunkt, UV-visuel spektroskopi, infrarødt og kernemagnetisk resonans (1H, 13C og DEPT-Q) teknikker. Massespektroskopi blev anvendt til at bekræfte identiteten af en af de mest aktive forbindelser, 5 . Phenylhydrazonerne viste aktivitet mod alle de seks udvalgte mikroorganismer med minimumsinhibitoriske koncentrationer (MIC-værdier) for de mest aktive forbindelser, 1 og 5 , på henholdsvis 138 µM (Klebsiella pneumoniae) og 165 µM (Streptococcus pneumoniae). Forbindelse 1 udviste desuden en høj resistensmodulerende aktivitet på 1,078 µM mod Streptococcus pneumoniae og Klebsiella pneumoniae.

1. Indledning

Verden er i de seneste årtier ved at løbe tør for effektive antibiotika på grund af den øgede forekomst af multiresistente organismer . Dette har ført til en stigning i resistente infektioner, hvilket kræver, at forskerne uophørligt udforsker muligheden for at syntetisere analoger af aktive eller ledende forbindelser som nye antimikrobielle stoffer for at dæmme op for disse infektioner og deraf følgende sygdomme. Infektionssygdomme er i århundredernes løb blevet en stor trussel mod menneskehedens eksistens, da de fortsat har en betydelig negativ indvirkning på samfundet. Patogene agenser som f.eks. bakterier, vira, svampe og parasitter fortsætter med at dukke op og er på vej op, især i det 21. århundrede, på trods af adskillige forsøg på at begrænse dem. Infektionssygdomme er skyld i, at ca. 17 millioner mennesker dør hvert år, og der opstår mindst 30 nye sygdomme. Verden kæmper i øjeblikket mod pandemien COVID-19 forårsaget af corona-virus, som allerede har kostet over 25 000 mennesker livet på verdensplan inden for tre måneder (WHO, 2020). Disse sygdomme truer millioner af menneskers sundhed, især fordi der ikke findes nogen kur eller vaccine. Den stigende tendens til mikrobielle infektioner skyldes i høj grad det evige problem med antimikrobiel resistens, som er på vej opad. De vigtigste myriader af årsager til antimikrobiel resistens omfatter langvarig kemoterapi og manglende overholdelse af doseringsregimer .

Den voksende resistens over for antibiotika har ført til en stigende tendens til patogener som methicillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA), multiresistent Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) og multiresistent Escherichia coli (MDR-Escherichia coli) . Desuden er ESKAPE-patogenerne (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa og Enterobacter-arter) af størst betydning for behandlingen af nosokomielle infektioner . Deres tilstedeværelse i infektioner har været en bekymrende situation i sundhedssektoren, da de fleste af dem er resistente over for mange antibiotika, og forståelsen af mekanismen bag disse stammers resistens er nyttig for udviklingen af nye antimikrobielle midler .

Verdenssundhedsorganisationen har gjort det klart, at tendensen med stigende infektionssygdomme vil fortsætte på grund af en række faktorer, herunder migration fra land til by, stigning i den globale befolkning, mikrobiel tilpasning og klimaændringer . Disse faktorer vil fremme fremkomsten og spredningen af patogener, så interessenter, herunder medicinske kemikere, opfordres løbende til at udforme strategier til at opdage nye kemoterapeutiske midler til at overvinde truslen om antimikrobiel resistens . En forbindelses resistensmodulerende aktivitet er forbindelsens evne til at have en kontrollerende indflydelse på allerede kendte standarder, især på en positiv måde. På grund af mikroorganismers stigende resistens over for antibiotika synes midler fra naturlige eller syntetiske kilder at modulere aktiviteten af nogle standardantimikrobielle midler såsom amoxicillin (a), ciprofloxacin (b) og fluconazol (c) (figur 1).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figur 1

Kemiske strukturer for nogle standardantibiotika : (a) amoxicillin; (b) ciprofloxacin; (c) fluconazol.

Resistensmodulerende aktiviteter af produkter (både naturlige og syntetiske) på standardantibiotika har vundet videnskabelig interesse i de seneste år. Dette har til formål at maksimere den antimikrobielle styrke med store skridt i retning af at bremse mikrobiel resistens og dermed føre til potentiel lægemiddelopdagelse. En vigtig klasse af sådanne syntetiske stoffer med lovende resistensmodulerende virkning er hydrazoner . Hydrazoner og deres analoger har azomethinfunktionalitet, som er en vigtig gruppe af forbindelser med et bredt spektrum af biologiske aktiviteter . Hydrazonerne blev valgt på grund af deres brede vifte af farmakologiske aktiviteter som f.eks. antikonvulsive, antiinflammatoriske, antimikrobielle, antiprotozoiske og kræftbekæmpende aktiviteter. De spiller en afgørende rolle ikke kun i biologien, men også inden for fotokemi, analytisk kemi og uorganisk kemi. Hydrazoner er beslægtet med ketoner og aldehyder ved substitution af oxygen med en -NNH2-funktionel del. På grund af varierende syntetiske protokoller og detaljerede undersøgelser af struktur-aktivitetsforholdet (SAR) er forskellige hydrazonderivater blevet udviklet og opdaget som farmakologisk aktive mod forskellige mål . Nogle hydrazonderivater af isonicotinoyl har vist sig at besidde antituberkulær aktivitet. Endvidere viste benzoesyrehydrazonderivat 4-hydroxybenzoesyre -hydrazid (nifuroxazid) sig at være aktivt mod tarmorm, og derivat 4-fluorbenzoesyre -hydrazid viste antibakteriel aktivitet mod Staphylococcus aureus ATCC 29213 ved 3,13 μg/mL og modtagelig Mycobacterium tuberculosis stamme H37RV også ved 3,13 μg/mL . Nyligt syntetiserede hydrazoner, herunder nifuroxazid, viste sig at være aktive mod Mycobacterium tuberculosis stamme H37RV ved en mindste hæmmende koncentration på 0,78-6,25 μg/ml. Et nyt middel, 3, 5-dibenzoylvanillinhydrazon, og overgangsmetalkomplekser viste sig at udvise imponerende antibakteriel aktivitet .

Dermed er seks nye phenylhydrazonderivater i denne undersøgelse blevet syntetiseret med succes ved nukleofil kondensationsreaktion, og deres antimikrobielle aktiviteter og resistensmodulerende virkninger er blevet undersøgt.

2. Materialer og metoder

2.1. Syntese: Generelle materialer og metoder

En rundbundskolbe (100 mL) udstyret med en magnetisk omrøringsstang blev fyldt med 2,4-dinitrophenylhydrazin (1 ækv.) i methanol (10 mL), der blev holdt i et isbad. Den resulterende suspension blev omrørt og afkølet til 0 °C, hvorefter koncentreret H2SO4 (98 % v/v, 2 mL) blev tilsat drypvis, hvilket gav en lysegul opløsning. Efter afkøling til stuetemperatur blev der tilsat et aldehyd- eller ketonderivat (1,04 ækvivalenter) i methanol (5 mL), og blandingen blev omrørt, indtil der gradvist dannedes et bundfald, som blev ladet stå i 24 timer. De kemiske reaktioners forløb blev overvåget ved hjælp af tyndtlagskromatografi (TLC) med mellemrum ved hjælp af aluminiumsplader belagt med silicagel (60 GF254). Pladerne blev visualiseret under UV-lys ved 254 nm og 366 nm, hvorefter de blev sprøjtet med anisaldehyd for at bekræfte pletternes identitet. Råproduktet blev filtreret ved sugefiltrering og omkrystalliseret fra varm absolut ethanol (96 % v/v). Det faste produkt blev opnået ved sugefiltrering, tørret og opbevaret ved stuetemperatur.

Strukturerne af de syntetiserede forbindelser blev fastlagt med smeltepunktsbestemmelser, massespektroskopi, 1D NMR (proton og carbon-13) og 2D NMR (DEPT-Q) spektroskopi med støtte af infrarøde (IR) og ultraviolet-visible (UV-Vis) spektroskopiteknikker.

2.1.1.1. 1-(2,4-Dinitrophenyl)-2-(diphenylmethylen)hydrazin

2, 4-Dinitrophenylhydrazin (0,50 g, 2,74 mmol, 1 ækv.) i nærværelse af benzophenon (0,53 g, 1,04 ækv., 2,64 mmol) gav det rå produkt, som blev renset ved omkrystallisering fra varm ethanol for at opnå produktet (0,84 g, 85%) som et lysorange fast stof. (Pet. ether 70%: EtOAc 30%): 0,90. Mpt: 141-143°C; UV-V er (MeOH) : 382 nm. Infrarødt (ren) υmax cm-1: 3382 (OH), 3286 (NH), 1586 (C = CH), 848, 614 (ArH). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 11,24 (1H, H-C1, s, NH), 9,09-9,10 (1H, H-C3, s, ArH), 8,41 (1H, H-C5, d, J = 2,4, ArH), 8,37-8,38 (1H, H-C6, m, ArH), 7,37-8,38 (1H, H-C6, m, ArH), 7,37-8,38 (1H, H-C6, m, ArH), 8,41 (1H, H-C5, d, J = 2,4, ArH).66-7.72 (5H, H-C4′, H-C5′, H-C6′, H-C5′, H-C5′, H-C3′, m, ArH), 7.35 (3H, H-C6″, H-C5″, H-C4″, m, ArH), 7.57 (2H, H-C5′, H-C3′, m, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz; CDCl3) 155,7, 145,1, 136,5, 131,9, 130,5, 130,4, 130,1, 129,9, 128,6, 128,2, 127,9, 123,4, 116,6 ppm.

2.1.2. 1-Benzyliden-2-(2,4-dinitrophenyl)-hydrazin

2, 4-Dinitrophenylhydrazin (0,90 g, 4,53 mmol, 1 eq.) i tilstedeværelse af benzaldehyd (0,50 g, 1,04 eq., 4,71 mmol) gav det rå produkt, som blev renset ved omkrystallisering fra varm ethanol for at opnå produktet (1,01 g, 78%) som et gult fast stof. (Pet. ether 70%: EtOAc 30%): 0,83. Mpt: 178-180°C; UV-V er (MeOH) : 224 nm og 378 nm. Infrarødt (ren) υmax cm-1: 3337 (OH), 3283 (NH), 3100 (C = CH), 1618, 1584 (ArC = C). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11.24 (1H, H-C1, s, NH), 9.09 (1H, H-C3, s, ArH), 8.30-8.31 (1H, H-C1′, s, N = CH), 8.05 (1H, H-C5, m, ArH), 8.30-8.31 (1H, H-C1′, s, N = CH), 8.05 (1H, H-C5, m, ArH), 8.02 (1H, H-C6, m, ArH), 7.41-7.69 (2H, H-C2′, H-C6′, m, ArH), 7.40 (1H, H-C4′, m, ArH), 7.39 (2H, H-C3′, H-C5′, m, ArH). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 147,9, 145,8, 144,9, 144,7, 131,0, 130,0, 129,0, 127,6, 123,5, 116,8 ppm.

2.1.3. 3-(2-2-(4-Dinitrophenyl) Hydrazono) Methylphenol

2, 4-Dinitrophenylhydrazin (0,78 g, 3,93 mmol, 1 ækv.) i nærvær af m-hydroxybenzaldehyd (0,50 g, 1,04 ækv, 4,09 mmol) gav råproduktet, som blev renset ved omkrystallisering fra varm ethanol for at opnå produktet (0,76 g, 64%) som et mørkerødt fast stof. (Pet. Ether 70%: EtOAc 30%): 0,74. Mpt: 277-280°C. UV-Vis (MeOH): 392 nm. Infrarødt (ren) υmax cm-1: 3420 (OH), 3257 (NH), 3116 (C = CH), 1607, 1584 (ArC = C). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11.56 (1H, H-C1, s, NH), 10.04 (1H, H-C2′, s, ArOH), 8.88 (1H, H-C3, s, ArH), 8.86 (1H, H-C7, s, N = CH), 8.35-8.37 (1H H-C5, d, J = 8.0, ArH), 8,08-8,34 (1H, H-C6), d, J = 12,0, ArH), 8,05 (1H, H-C5′, m, ArH), 7,66 (1H, H-C1′, s, ArH), 7,14 (1H, H-C4′, m, ArH), 6,87-6,89 (1H (H-C3′, m, ArH). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 160,5, 150,5, 144,9, 137,1, 130,2, 130,2, 129,8, 129,5, 125,2, 123,6, 117,1, 116,4 ppm.

2.1.4. 4-(2-(2-(2,4-Dinitrophenyl) Hydrazono) Methyl)-2-methoxyphenol

2, 4-Dinitrophenylhydrazin (0,78 g, 3,93 mmol, 1 ækv.) i nærværelse af 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd (vanillin) (0,50 g, 1,04 ækv, 4,09 mmol) gav råproduktet, som blev renset ved omkrystallisering fra varm ethanol for at opnå produktet (0,91 g, 70%) som et klart rødt fast stof. (Pet. ether 70%: EtOAc 30%): 0,66. Mpt: 270-273°C. UV-Vis (MeOH): 218 nm og 394 nm. Infrarødt (ren) υmax cm-1: 3363 (OH), 3274 (NH), 3111 (C = CH), 1605 (ArC = C), 699 (ArH). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11.58 (1H, s, NH), 10.11 (1H, H-C4′, s, ArOH), 9.94 (1H, H-C3, s, ArH), 8.87 (1H, H-C5, s, ArH), 8.86 (1H, H-C7, s, N = CH), 8.35 (1H, H-C6, d, J = 4.0, ArH), 7,97 (1H, H-C2′, d, J = 4,0, ArH), 7,66-7,76 (1H, H-C6′, d, J = 8,0, ArH), 6,38-6,35 (1H, H-C5′, d, J = 12,0, ArH), (3H, H-C4′, Ar-OCH3). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 150,7, 150,2, 148,6, 144,9, 137,1, 130,2, 125,6, 123,6, 123,1, 117,2, 116,1, 110,3, 56,2 ppm.

2.1.5. (Z)-2-(2, 4-Dinitrophenyl) Hydrazono) Methyl Phenol

2, 4-Dinitrophenylhydrazin (0,78 g, 3,93 mmol, 1 eq.) i tilstedeværelse af salicylaldehyd (0,50 g, 4,09 mmol, 1,04 eq.) gav det rå produkt, som blev renset ved omkrystallisering fra varm ethanol for at opnå produktet (1,09 g, 92%) som et lysorange fast stof. (Pet. ether 70%: EtOAc 30%): 0,84. Mpt: 176-180°C; UV-Vis (MeOH): 386 nm. Infrarødt (ren) υmax (cm-1): 3334 (OH), 3267 (NH), 3059 (C = CH), 1583 (ArC = C), 759 (ArH) 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,25 (1H, H-C3′, s, ArOH), 9,98 (1H (C1), s, NH), 9,11 (1H H-C3, s, ArH), 8,34-8,34-8,34 (1H, H-C3′, s, ArH), 9,11 (1H, H-C3′, s, ArH), 9,11 (1H, H-C3′, s, ArH).36 (1H, H-C1′, s, N = CH), 8,33 (1H, H-C5, d, J = 4,0, ArH), 7,61-7,58 (1H, H-C6, d, J = 4,0, ArH), 7,61-7,58 (1H, H-C6, d, J = 4,0, ArH), 7.31 (1H, H-C6′, m, ArH), 7,25 (1H, H-C4′, m, ArH), 7,24 (1H, H-C7′, m, ArH), 6,95 (1H, H-C5′, m, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 157,9, 151,3, 132,9, 131,4, 130,6, 130,6, 123,7, 120,3, 117,2, 116,9, 115,3 ppm. HRMS (ESI): m/z beregnet for + C13H10N4O5: 302.2400, fundet: 301.0000.

2.1.6. 4-(2-(2-(2, 4-Dinitrophenylhydrazono) Methyl) Benzen-1, 3-diol

2, 4-Dinitrophenylhydrazin (0,69 g, 3,48 mmol, 1 ækv.) i nærvær af 2, 4-dihydroxybenzaldehyd (0,50 g, 1,04 ækv, 3,62 mmol) gav det råprodukt, som blev renset ved omkrystallisering fra varm ethanol for at opnå produktet (0,66 g, 2,07 mmol, 60%) som et mørkerødt fast stof. (Pet. ether 70%: EtOAc 30%): 0,51. Mpt: 270-274°C; UV-Vis (MeOH) : 403 nm. Infrarødt (ren) υmax (cm-1): 3364 (OH), 3094 (C = CH), 1612, 1584 (ArC = C) 592 (ArH). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 11,58 (1H, H-C3′, s, ArOH), 10,11 (1H, H-C1, s, NH), 9,94 (1H, H-C5′, s, ArOH), 8,87 (1H, H-C3, s, ArH), 8,86 (1H, s, N = CH), 8,86 (1H, s, N = CH), 8,94 (1H, H-C5′, s, ArOH), 8,87 (1H, H-C3, s, ArH), 8,86 (1H, s, N = CH).33 (1H, H-C4′, s, ArH), 8,36 (1H, H-C5, d, J = 12,0, ArH), 7,95-7,97 (1H, H-C6, d, J = 8,0, ArH), 7,54 (1H, H-C7, m, ArH), 6,38 (1H, H-C6′, d, J = 8,0, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz, DMSO-d6) 161,8, 159,1, 148,2, 144,6, 136,7, 130,1, 129,3, 128,8, 123,6, 116,9, 112,0, 108,7, 102,1 ppm.

2,2. Antimikrobiel evaluering af forbindelserne

2.2.2.1. Kilde til testorganismer

Rene kulturer af Staphylococcus aureus (SA) (ATCC 25923), Escherichia coli (EC) (ATCC 25922) og Pseudomonas aeruginosa (PA) (ATCC 27853) blev indhentet fra mikrobiologiafdelingen på Institut for Farmaci, fakultetetet for farmaci og farmaceutiske videnskaber, Kwame Nkrumah University of Science and Technology (KNUST), Kumasi. Klebsiella pneumoniae (KP), Candida albicans (CA) og Streptococcus pneumoniae (SP) var imidlertid kliniske stammer fra Komfo Anokye Teaching Hospital, Kumasi, og dyrket på Institut for Farmaci, KNUST.

2.2.2.2. Bestemmelse af mindste hæmmende koncentration (MIC)

Mikrobrothfortyndingsmetoden blev anvendt til bestemmelse af de mindste hæmmende koncentrationer (MIC’er) af hydrazonderivaterne og referencelægemidlerne ciprofloxacin og fluconazol. Mikrotiterplader med 96 brønde blev fyldt med 125 µL dobbeltstyrke næringsbouillon, og forskellige koncentrationer af hydrazonderivaterne blev tilsat. Referencelægemidlerne i intervallet 12.5 µL/mL til 40 µL/mL blev behandlet på samme måde. En alikvot på 1 × 105 cfu/mL af testorganismer blev tilsat til hver brønd. Kontrolpladen blev kun fyldt med næringsbouillon og testorganismer. Test- og kontrolpladerne blev inkuberet ved 37 °C (24 timer for bakterier og 48 timer for svampe), hvorefter 20 µL af 1,25 mg/ml 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) blev tilsat til hver brønd. Der blev foretaget observationer efter 20 minutter for at se, om der var en lilla farvning, hvilket indikerer vækst. De minimumskoncentrationer af hydrazonderivaterne og referencelægemidlerne, som ikke viste farveændring i brøndene, blev anset for at være MIC-værdierne . Bestemmelserne blev udført i gentagelser.

2.2.3. Resistente modulationsundersøgelser

For modulationsundersøgelserne blev 96-brøndepladerne fyldt med 125 µL dobbeltstyrke næringsbouillon, og der blev tilsat samme mængde 40 µL phenylhydrazoner. Forskellige koncentrationer i intervallerne 50 µL/ml til 7,812 µL/ml og 15,625 µL/ml til 7,812 µL/ml af henholdsvis ciprofloxacin og fluconazol blev tilsat. Der blev tilsat 25 µL indeholdende 1 × 105 cfu af testorganismer til hver brønd, og pladerne blev inkuberet ved 37 °C (i henholdsvis 24 og 48 timer for bakterier og svampe), hvorefter der blev tilsat 20 µL MTT til hver brønd. Forekomsten af en farveændring fra uklare brønde til lilla blev registreret og kun sammenlignet med MIC’er for referencelægemidlerne . Bestemmelserne blev udført i gentagelser.

3. Resultater og diskussion

3.1. Strukturanalyse af phenylhydrazonerne

Den syntetiske rute, der blev anvendt til syntesen af forbindelserne, blev fulgt af standardkondensationsreaktionen mellem aldehyder eller ketoner og hydraziner, idet der blev taget hensyn til den kommercielle tilgængelighed af byggestenene (skema 1). En retrosyntetisk afbrydelsestilgang gjorde det muligt for os at identificere forskellige aldehyder og en keton som nøgleintermediater til syntese af de ønskede forbindelser. Processen indebærer et hastighedsbestemmende aromatisk nukleofilt angreb af 2,4-dinitrophenylhydrazin på carbonyl i en syrnet opløsning. Dette blev efterfulgt af dehydrering af det reaktive mellemprodukt for at give slutproduktet 2, 4-dinitrophenylhydrazonderivat.

3.1.3. Nuclear Magnetic Resonance (NMR)-spektroskopi

NMR-bestemmelser blev udført for alle de seks syntetiserede phenylhydrazoner ved hjælp af en endimensional (1D) NMR-teknik (1H og 13C) og en todimensional NMR-teknik, distortionless enhancement by polarization transfer for quaternary carbons (DEPT-Q). Disse data er tildelt hver forbindelse i det eksperimentelle afsnit. Strukturerne blev bekræftet med 1H NMR-, 13C NMR- og DEPT-Q-spektraldata som vist i de supplerende oplysninger for henholdsvis BP1, BA2, MHB3, VL4, SA5 og DHB6-forbindelserne. Med hensyn til DHB6 (forbindelse 6) (figur 2, tabel 1) og fra proton-NMR (supplerende oplysninger) viste et kemisk skift, der viste resonans langt nede i feltet, tilstedeværelsen af hydroxyprotonen med et singlet-signal. Den resonerede længere nede i feltet end den sekundære aminproton på grund af den øgede afskærmende effekt af den elektronegative oxygen . Denne kemiske forskydning var lidt højere end hydroxylgruppens ( 9,94 ppm), fordi førstnævnte er tættere på det kemiske miljø for det elektronegative nitrogenatom i iminbindingen. Derfor blev det første hydroxy-singlet-signal ved 11,54 ppm efterfulgt af et singlet-signal sekundær aminoproton ved 10,11 på grund af nitrogengruppens elektronegativitet før det andet hydroxysignal. Den aromatiske proton, der er indlejret mellem to elektronegative nitrogrupper, var det næste signal, der gav genlyd nede i feltet ved 8,86 ppm. Dette blev efterfulgt af protonen tæt på den tertiære aminogruppe. Den tertiære aminogruppe, der er knyttet til iminprotonen, forårsagede afskærmning og resonans i det nedre felt af iminprotonerne ved 8,86 ppm med et singletsignal. Den lone proton, der er tættest på nitrogruppen i para-positionen, var det næste signal med et doublet-top ved 7,95-7,97 ppm. Den anden lone proton, der er tættest på den mindre elektronegative sekundære aminogruppe, gav også et doublet-signal ved 7,64-7,66 ppm. De to andre lone-protoner (den ene mellem diolen og den anden ortho til iminbindingen) gav et multipletsignal ved 7,52-7,54 ppm, mens protonen tættest på para-hydroxygruppen og to kulstofbindinger væk fra imingruppen gav et doubletsignal ved 6.38 ppm.

Figur 2

Kemisk struktur af DBH6 (forbindelse 6) .

DEPT-Q anvendes til differentiering af de primære, sekundære, tertiære og kvaternære kulstofatomer. I DEPT-Q vises methyl- (CH3) og methinsignalerne (CH) opad i den positive fase, mens methylen- (CH2) og kvaternære signaler vises nedad i den negative fase. DEPT-Q-spektret af DHB6 (supplerende oplysninger) afslører tilstedeværelsen af opadgående kulstofsignaler, der i dette tilfælde kun repræsenterer seks metinkulbrinter, der forekommer ved 161,8, 159,1, 148,2, 136,7, 130,1 og 112,0, hvilket bekræfter de aromatiske metinkulbrinter og syv kvaternære kulbrinter, der forekommer ved 148,2, 130,1, 129,2, 123,6, 116,9, 108,7 og 102,9. DEPT-Q for de andre forbindelser kan findes i de supplerende oplysninger.

3.1.4. Massespektroskopi

Massespektroskopi anvendes til bestemmelse af nøjagtige molekylvægte og fragmentering af forbindelser ved hjælp af ioniseringsteknikker . Forbindelse SA5 phenylhydrazon var en af de mest aktive forbindelser efter antimikrobiel evaluering. Fra elektrospray-ionisering (ESI) massespektret var molekylærion-toppen i negativ tilstand 301.0000 (M-H+), som er den faktiske masse med et toleranceområde på 0,24 (0,41%) fra den teoretiske masse på 302.2400. Dette bekræftede molekylvægten af forbindelse SA5.

Massespektroskopien blev anvendt til at bekræfte molekylvægten af en af de mest aktive forbindelser og blev derfor ikke anvendt på de andre.

4. Antimikrobiel evaluering

4.1. Minimale hæmmende koncentrationer (MIC)

Minimale hæmmende koncentration (MIC) er den mindste koncentration af et antimikrobielt middel, der hæmmer den synlige vækst af patogenet efter 24 timer (bakterier) og 48 timer (svampe) inkubation . MIC for phenylhydrazonerne og to standardantibiotika (ciprofloxacin og fluconazol) blev evalueret ved hjælp af mikrobrothfortyndingstest mod et panel af seks patogene mikroorganismer:

Alle forbindelser viste svag antimikrobiel aktivitet mod testorganismer ved testkoncentrationer som observeret i tabel 2. BP1 viste den højeste antimikrobielle aktivitet blandt de seks forbindelser mod de udvalgte testorganismer. BA2 havde imidlertid den mindste antimikrobielle aktivitet med en MIC på 699 µM mod alle testorganismer. MHB3 havde en MIC på 562 µM mod C. albicans og 662 µM og derover mod resten af testorganismerne. VL4 registrerede en MIC på 602 µM mod alle testorganismer undtagen S. pneumoniae (MIC = 300 µM). SA5’s MIC’er mod S. pneumoniae og K. pneumoniae var henholdsvis 165 µM og 331 µM, mens den for S. aureus, E. coli, P. aeruginosa og C. albicans havde en højere MIC på 662 µM. DHB6 viste aktivitet mod S. pneumoniae, K. pneumoniae og C. albicans med en MIC på 314 µM, mens den for S. aureus, E. coli og P. aeruginosa havde en MIC på 628 µM og derover. Det anvendte antibakterielle referencelægemiddel var ciprofloxacin, og de registrerede MIC’er var 2,36 µM mod P. aeruginosa, S. pneumoniae og K. pneumoniae, mens der blev registreret 4,72 µM mod S. aureus og E. coli. Det anvendte svampedræbende referencelægemiddel var fluconazol, og den opnåede MIC-værdi var 327 µM mod C. albicans. MIC for phenylhydrazonerne mod de to gramnegative organismer varierede fra 552 µM til 699 µM, mens standarden ciprofloxacin lå på henholdsvis 4,72 og 2,36 µM (tabel 2).

4.2. Resistent modulationsaktivitet

Tendensen af phenylhydrazonerne ved sub-MIC’er til at forbedre aktiviteterne af nogle kommercielle antibiotika mod kendte resistente stammer blev undersøgt ved hjælp af den resistente modulationstest. Af tabel 2 og 3 fremgår det, at BP1 (forbindelse 1) med en sub-MIC på 50 µM mod S. pneumoniae sænkede MIC for ciprofloxacin fra 2,36 til 1.078 µM svarende til en reduktion på 54,32 % af MIC for ciprofloxacin. BP1 forbedrede også ciprofloxacins ydeevne ved sub-MIC på 50 µM mod K. pneumoniae fra 2,36 µM til 1,078 µM, hvilket svarer til en reduktion på 54,32 % i antibiotikaets MIC. Igen modulerede BP1 fluconazols aktivitet mod C. albicans fra 327 til 2,156 µM, hvilket svarer til en reduktion på 99,34 % af fluconazolets MIC. Tilsvarende forbedrede BA2 ciprofloxacins aktivitet mod S. pneumoniae og reducerede MIC for ciprofloxacin fra 2,36 til 1,36 µM, hvilket viser en reduktion på 42,37 %. Desuden modulerede BA2 også aktiviteten af fluconazol ved sub-MIC på 50 µM mod C. albicans og forårsagede en reduktion i dets MIC fra 327 til 1,23 µM, hvilket indikerer en reduktion på 99,6 % i MIC.

MHB3 modulerede ciprofloxacins aktivitet mod S. pneumoniae og Klebsiella pneumoniae, hvilket forårsagede en reduktion i antibiotikas MIC fra 2,36 til 1,29 µM. Dette fald i MIC indikerede en reduktion på 45,33 %. MHB3 viste også modulation af fluconazols aktivitet ved sub-MIC på 50 µM mod Candida albicans og sænkede MIC til 5,109 fra 327 µM, hvilket indikerer en maksimal reduktion på 98,43 %. VL4 forbedrede ciprofloxacins ydeevne ved sub-MIC på 50 µM mod S. pneumoniae og K. pneumoniae. Antibiotikaets MIC faldt fra 2,36 til 1,176 µM. i begge tilfælde. Dette fald i MIC viser en reduktion på 50,17 %. VL4 modulerede igen fluconazols ydeevne ved sub-MIC på 50 µM mod C. albicans og sænkede MIC til 1,176 µM fra 327 µM, hvilket viste en maksimal reduktion på 99,64 %.

Dertil kommer, at forbindelse 5 (SA5) modulerede aktiviteten af ciprofloxacin ved sub-MIC på 50 µM mod S. pneumoniae og K. pneumoniae. MIC blev sænket fra 2,36 til 1,29 µM i begge tilfælde, hvilket resulterede i en reduktion på 45,34 %. SA5 modulerede igen fluconazols ydeevne ved sub-MIC på 50 µM mod C. albicans og undertrykte dets MIC fra 327 til 1,29 µM, hvilket indikerer en god reduktion på 99,61 %. DHB6 (forbindelse 6) modulerede også ciprofloxacins aktivitet ved sub-MIC på 50 µM mod S. pneumoniae og K. pneumoniae og sænkede dets MIC fra 2,36 til 1,23 µM i begge tilfælde, hvilket svarer til en reduktion af MIC på 47,88 %. DHB6 modulerede også aktiviteten af fluconazol ved sub-MIC på 50 µM mod C. albicans og sænkede dets MIC fra 327 µM til 1,23 µM svarende til 99,62 % reduktion i MIC. SA5 og BP1 var bedre end de andre fire phenylhydrazoner med hensyn til resistensmodulerende aktivitet sammen med ciprofloxacin, som havde en MIC på 2,58 µM mod P. aeruginosa, efterfulgt af BP1 (17,2 µM). Derfor kan tilstedeværelsen af en orthohydroxygruppe i SA5 og en aromatisk ketongruppe være afgørende for den resistensmodulerende aktivitet i kombination med ciprofloxacin over for Gram-negative P.aeruginosa og E. coli. Desuden forbedrede tilstedeværelsen af en metahydroxygruppe (MHB3), en hydroxy- og methoxygruppe (VL4) og fraværet af en substituent på benzaldehyddelen af BA2 også aktiviteten og kunne overvejes med henblik på fremtidig lægemiddeludvikling. K. pneumoniae, den anden Gram-negative modpart, som forårsager alvorlige infektioner, var mere modtagelig over for phenylhydrazonerne ved 138 til 699 µM. Ved at kombinere subinhibitoriske koncentrationer af phenylhydrazonerne med ciprofloxacin blev resistensbarrieren hos K. pneumoniae reduceret, hvilket gav mulighed for en langt lavere MIC på 1,078 fra 5,46 µM, en tendens, der er mere imponerende end for P. aeruginosa og E.coli.

Fenylhydrazonerne havde en lignende aktivitet mod de Gram-positive organismer fra 87,3 til 699 µM, hvilket også er tydeligt for de resistente egenskaber hos Staphylococcus aureus og Streptococcus pneumoniae.

5. Konklusion

Et bibliotek af seks nye phenylhydrazoner blev med succes syntetiseret og karakteriseret: 1-(2, 4-dinitrophenyl)-2-(diphenylmethylen) hydrazin , 1-benzyliden-2-(2, 4-dinitrophenyl) hydrazin , 3-(2-2-(4-dinitrophenyl) hydrazono) methylphenol, 4-(2-(2, 4-dinitrophenyl) hydrazono) methyl)-2-methoxyphenol , (Z)-2-(2, 4-dinitrophenyl) hydrazono) methylphenol og 4-(2-(2, 4-dinitrophenylhydrazono) methyl) benzen-1, 3-diol.

Som en del af fremtidig lægemiddeldesign og -optimering kan phenylhydrazonerne betragtes som strukturelle backbones på grund af deres syntetiske gennemførlighed og gode udbytte. Forbindelserne udviste en svag antimikrobiel egenskab, men demonstrerede en stærk resistent modulerende virkning, når de blev kombineret med standardlægemidlerne. Aktiviteterne af standarderne blev forbedret betydeligt med en god reduktion i MIC-værdierne.

Abkortninger

Data tilgængelighed

Data fra forskningen er tilgængelige i arkiverne på Department of Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Kwame Nkrumah University of Science and Technology.

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter i forbindelse med offentliggørelsen af denne artikel.

Authorers bidrag

A.A., A.B., I.A., Y.D.B., C.D.K.A., og B.K.H. udtænkte forskningsarbejdet og udarbejdede manuskriptet. C.D. K.A., A.B. og A.A. har designet og udført syntesen af stofferne. C.D.K.A., A.A. og I.A. udviklede den konceptuelle ramme og udarbejdede manuskriptet. C.D.K.A. og B.K.H. fortolkede spektralresultaterne og udførte strukturopklaringen. Y.D.B. og A.A. udførte den antimikrobielle in vitro-analyse og leverede de eksperimentelle data og fortolkningen af resultaterne.

Anerkendelser

Forfatterne er meget taknemmelige over for alle ansatte og teknikere på Department of Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmacy, KNUST, Kumasi, Ghana, for deres støtte. Forfatterne er meget taknemmelige over for Francis Amankwah fra Department of Pharmaceutics (Microbiology Section), KNUST, for den tekniske støtte.

Supplementary Materials

Den supplerende fil indeholder alle spektrer. (Supplerende materialer)