Vad är SMRT-sekvensering (Single-Molecule Real-Time)?

Av Dr. Maho Yokoyama, Ph.D.Recenserad av Christian Zerfaß, Ph.D.

Hoppa till:

• Hur fungerar SMRT-sekvensering?
• Studier av DNA-metylering i bakterier; en tillämpning av SMRT-sekvensering

DNA-sekvensering fungerar genom att använda DNA-polymeras för att lägga till nukleotider till en mall. Det finns flera tekniker tillgängliga för DNA-sekvensering. Ett sådant exempel är Single-Molecule Real-Time sequencing, eller SMRT-sekvensering.

Forskare som undersöker DNA-sekvenser på transparenta bilder. Credit: Shawn Hempel /

Hur fungerar SMRT-sekvensering?

Som med andra DNA-sekvenseringstekniker är det första steget efter DNA-extraktion att förbereda ett ”bibliotek”. Denna process förbereder DNA:t för sekvensering; i det här fallet läggs adaptrar till i vardera änden av en dubbelsträngad DNA-molekyl, vilket i praktiken gör det möjligt för DNA:t att bli en enkelsträngad cirkulär mall. Detta innebär sedan att DNA:t kan sekvenseras kontinuerligt.

Detta DNA-bibliotek, eller mall-DNA:t, sätts sedan in i en DNA-sekvensator som innehåller ”zero mode waveguides” som har DNA-polymeras immobiliserat i ena änden. En enskild DNA-molekyl immobiliseras sedan i dessa nollmodiga vågledare, och DNA-polymeraset börjar lägga till nya nukleotider till en de novo-syntetiserad DNA-sträng som är komplementär till mall-DNA:et. Baserna i dessa nukleotider är märkta, och inkorporering av dessa baser i den växande DNA-strängen orsakar ljusemission. Denna ljusemission avläses sedan i realtid, och eftersom emissionen från varje bas är olika gör detta det möjligt att identifiera den specifika basen.

Den största fördelen med SMRT-sekvensering är genereringen av långa sekvenseringsavläsningar med hög noggrannhet, vilket förbättrar sammansättningen av hela genomer. Detta beror på att längre sekvenseringsavläsningar innebär att det krävs mindre ”byggande” för att sätta ihop genomet.

Studier av DNA-metylering i bakterier; en tillämpning av SMRT-sekvensering

Vad är DNA-metylering?

Anslutningen av en metylgrupp till DNA, även känd som metylering, förekommer i alla livets riken. Det finns tre metylerade nukleotider i bakterier; m5C (C5-metyl-cytosin, som också finns i eukaryoter), m6A (N6-metyl-adenin) och m4C (N4-metyl-cytosin, som bara finns i bakterier). Metylering sker efter syntesen av nya DNA-strängar och sker vid specifika nukleotider.

Metylgrupperna sticker ut ur DNA:s dubbelhelix och kan därför påverka bindningen mellan DNA och DNA-bindande proteiner. Detta påverkar i sin tur processer som kromosomreplikation, reparation av DNA-missmatchningar samt tidpunkten för gentranskription och bildandet av epigenetiska linjer.

Epigenetiska mekanismer: metylering eller acetylering av dna kan aktivera eller inte aktivera gentranskriptionen. Image Credit: ellepigrafica /

Varför är dna-metylering viktigt i bakterier?

Bakterier infekteras av virus och behöver därför en skyddsmekanism för att övervinna virusinfektioner. Det är här restriktionsmodifieringssystem kommer in i bilden; detta system består av ett restriktionsenzym, som bryter ner DNA på specifika ställen, och ett DNA-metyltransferas, som lägger till en metylgrupp till adenin (A) eller cytosin (C).

I majoriteten av restriktionsmodifieringssystemen agerar DNA-metyltransferaset för att skydda bakterie-DNA:t från restriktionsenzymet. Närvaron av DNA-metyltransferaset innebär att bakterie-DNA:t blir metylerat, medan det infekterande virus-DNA:t inte blir det. Detta innebär i sin tur att virus-DNA bryts ned av restriktionsenzymet, medan bakterie-DNA skyddas på grund av att restriktionsenzymet inte verkar på metylerat DNA. Det bör dock noteras att det finns restriktionsenzymer som verkar på modifierat DNA.

Nyare studier har antytt att det kan finnas ytterligare roller för restriktionsmodifieringssystem. Att slå ut vissa restriktionsmodifieringssystem resulterade till exempel i en förändring av genuttrycket, vilket är kopplat till skillnaden i DNA-metylering. Restriktionsmodifieringssystem kan också orsaka dubbelsträngsbrott och C-T-mutationer och därmed påverka bakteriernas evolution. På senare tid har man utvecklat teknik som kan bestämma metyleringen av ett helt bakteriellt genom, det så kallade ”metylomet”.

Hur bestämmer man metylomet med hjälp av SMRT-sekvensering?

Då SMRT-sekvensering ger resultat i realtid kan den användas för att detektera DNA-modifieringar, inklusive metyleringar. DNA-polymeraset inkorporerar nukleotider med en konstant hastighet, men denna hastighet kan ändras om nukleotiden i mallen har modifierats. Detta kan noteras under sekvenseringsprocessen.

Blow at al. använde SMRT-sekvensering för att kartlägga DNA-modifieringar i 230 mikroorganismer. De modifieringar de letade efter var bland annat m5C, m6A och m4C. Författarna fann att 93 % av dessa mikroorganismer uppvisade DNA-metylering, och de hittade också 834 motiv som var metylerade. Detta gjorde det möjligt för författarna att identifiera vilka motiv som är måltavlor för 620 DNA-metyltransferaser.

Interessant nog noterade författarna att även om 48 % av de studerade organismerna hade ett DNA-metyltransferas fanns det inga tecken på att det också fanns ett restriktionsenzym. Det är därför möjligt att DNA-metylering spelar en viktig roll i regleringen av genomet, eller en annan viktig roll i mikroorganismer som ännu inte har identifierats.

Fortsatt läsning

• Allt innehåll om DNA-sekvensering
• DNA-sekvensering
• DNA-sekvensmontering
• DNA-mikroarray
• Tekniker för DNA-sekvensering med hög genomströmning

Skrivet av

Dr Maho Yokoyama

Dr Maho Yokoyama är forskare och vetenskapsskribent. Hon fick sin doktorsexamen från University of Bath, Storbritannien, efter en avhandling inom mikrobiologi, där hon tillämpade funktionell genomik på Staphylococcus aureus . Under sina doktorandstudier samarbetade Maho med andra akademiker om flera artiklar och publicerade även en del av sitt eget arbete i vetenskapliga tidskrifter med expertgranskning. Hon presenterade också sitt arbete vid akademiska konferenser runt om i världen.

Citat

.