Tredimensionell rekonstruktion av ätmaskinen hos fästingen Ixodes ricinus (Acari: Ixodidae): en ny inblick i mekanismen för blodätande

Röntgenbilder av honan I. ricinus

Här visar vi att röntgenuppsättningen CRYTUR (baserad på X-RayWorx mikrofokus, röntgenkälla och CRYCAM-röntgendetektor) är mycket lämplig för snabb och icke-förstörande observation av osmiumimpregnerade inre strukturer hos fästinghonor. Figur 1A visar chelicerala retraktormuskler som sträcker sig till området för benens andra par, kutikelns tjocklek, musklerna i benen och palperna (Fig. 1A, Movie 1). Den 3D-modell som erhållits från 2D-röntgenprojektionsbilder gav ytterligare rumslig information om ytliga strukturer i honans huvuddel (fig. 1B) som är jämförbar med förhandsbildningen med SEM (fig. 1D) med möjlighet att visualisera även vissa inre strukturer (t.ex. muskler, baser av chelicerae och pharynx) i olika virtuella skivor (fig. 1B). Upplösningen av röntgentomografin var 8 060 µm och beräknades på grundval av Fourieranalys från en rekonstruerad virtuell skiva i den laterala slätten som finns i mitten av det rekonstruerade objektet. Vi konstruerade en graf av det radiellt medelvärde av effektspektrumet och baserat på Rayleigh-kriteriet bedömer vi separation gränssignalen från bruset vid 8,94 % av avståndet mellan brusgolvet och toppvärdet. Eftersom röntgenmodellen rekonstruerades från projektionsbilderna i intervallet 0°-180° med steg 10° är upplösningen tekniskt sett nästan isotropisk. Denna upplösning var dock inte tillräcklig för att observera nymfala mundelar (fig. 1C,D, se jämförelsen av både honans och nymfala mundelars storlek vid samma förstoring).

Seriedragning SEM

Den 3D-modell av födosöksapparaten hos I. ricinus nymf som rekonstruerades från seriella ultratunna hartssektioner avslöjade relationer mellan salivarium och födokanal till kapillärstiletter (chelicerae, hypostome) och andra associerade strukturer, främst muskler (fig. 2, film 2 och 3)14.

Utternt från capitulum stöts saliv och blodmjöl ut/sugs in i en smal slits, den preorala kanalen, som bildas mellan hypostomens spår på den ventrala sidan och chelicerae på den dorsala sidan (fig. 2A). Hos Rhipicephalus (tidigare Boophilus) microplus ligger ett tunt membran, även kallat ränna, över den hypostomala rännan12. Intressant nog saknades denna struktur hos Ixodes hexagonus9, Haemaphysalis longicornus15 och I. ricinus. Inne i capitulum fortsätter saliv/blod in i salivarium, och denna gemensamma väg avslutas genom att en matkanal separeras från salivarium (fig. 2A, B). Från fästingens ryggsida ligger födokanalen under salivarium. Salivarium är inte en permanent fixerad struktur, utan skapas snarare genom att chelicerae placeras ovanför hypostomens dorsala sida. Födokanalen skiljs från den gemensamma vägen genom att mynna ut i svalget. Dess tak utgörs först av en liten lamell (fig. 2B, grön pil) som förstoras till en kort stav inom capitulumdjupet (fig. 2C,I grönt) och fortsätter som en större sklerotiserad vingliknande platta (även känd som alae) (fig. 2E,I, grönt). Alla dessa strukturer bildar tillsammans ett labrum. I den nedre delen av labrum finns en tandliknande process intill svalgöppningen (fig. 2C,E, svarta pilar). Denna tandliknande struktur har beskrivits hos I. hexagonus, I. holocyclus och Rhipicephalus microplus9,12,16. Den tandliknande processen verkar passa in i ett spår i svalgöppningen och antas därför vara en viktig del av svalgklaffen. Att identifiera denna tandliknande process som labrum motiveras av dess likhet med labrum hos argasidticka, som också sträcker sig från svalgtaket in i matningskanalen13,16. Den anatomiska strukturen hos födokanalen, det lilla labrum och ventilen hos I. ricinus stämmer överens med den långsamma födosöksprocessen hos dessa fästingar, där långa pulser av sugande alternerar med pulsen av salivutsöndring under deras långa period av blodsökning. Hos mjuka fästingar sträcker sig dock labrum distalt längs hela matningskanalens längd. Detta stämmer överens med den snabba födosöksprocessen hos dessa fästingar där snabba fladdringar av labrum synkroniseras med snabbt sugande och salivering för att äta inom endast 1-2 timmar13. Baserat på våra EM-observationer var denna främre del av svalgtaket inte kopplad till muskler och utgör troligen en stationär (stödjande) del av klaffen (fig. 2B). Svalgtaket är kopplat till subhypostomplattor som bildar sidhuvuden och ett golv i svalget (fig. 2C vita pilar). Dessa plattor är förbundna med de stora dilatatormuskelbanden som på sina motsatta sidor är fästa vid den ventrala kutikulan. Svalgets främre dilatatormuskler (ADM, som visas i fig. 2C, E, I som ljusrosa strukturer) är belägna endast i den främre delen av svalget och deras sammandragning/avslappning gör det möjligt att öppna/stänga ventilen i svalgöppningen9,12. ADM är fästa vid det övre hörnet och de djupa laterala sidorna av den främre delen av svalget. Den mellersta delen av farynxväggarna är förknippad med en annan grupp dilaterande muskler vars sammandragning utvidgar det faryngeala lumenet åt sidan. Dessa laterala dilatormuskler i svalget (LDM) kan ses i fig. 2G och som djupt rosa färgade strukturer i fig. 2I,J. LDM möjliggör en massiv utvidgning av svalglumen, möjligen också på grund av den dubbla Y-formade väggen i den främre delen (fig. 2G) och den tredubbla Y-formade väggen i den bakre delen av svalget i ett tvärsnitt (fig. 2H) som beskrivs av Arthur et al.9 och Sonenshine och Anderson13. Alternerande kontraktion och relaxation av de båda dilaterande muskelgrupperna utvidgar svalget, synkroniserat med öppnandet av den främre klaffen, vilket skapar en kraftfull sugpuls. Avslappning av LDM, efter stängning av svalgklaffen, pressar ihop svalget och driver det intagna blodet bakåt in i esofagus och mellangärdet. Tidssynkronisering mellan öppning/stängning av svalgöppningen, samordnad med öppning och stängning av svalgventilen och komprimering/utvidgning av lumen i den mellersta delen av svalget gör det möjligt att suga, liksom att förflytta födan in i matstrupen och förhindrar också att blodet regurgiteras tillbaka in i värddjuret9,12. Den inre slemhinnan i svalget är sklerotiserad, medan matstrupens vägg är klädd med epitelceller (fig. 2A). Ösofagus passerar genom synganglion och övergår i midgut (data ej visad).

Salivarium är ett stort hålrum som ligger mellan svalget och chelicerae (fig. 2A-E). Den främre delen av salivarium är gemensam för både blod- och salivpassage, därefter skiljs svalget från salivariumgolvet av den lilla lamellen (se ovan). Salivariumets tak och sidosidor förstärks av den sklerotiserade chelicerala plattan (ChP i fig. 2C,E,F och den röda strukturen i fig. 2M) som sträcker sig längre in i fästingkroppens hålighet. I den bakre delen av salivarium är de laterala sidorna av denna platta anslutna till muskler som i motsatta ändar är fästade vid de laterala sidorna av fästingens kroppshålighet. Dessa laterala muskler i salivarium (LMS) kan ses i figur 2E, F, K och L markerade med ljuslila färg. Musklernas sammandragning plattar till plattan, som är tätt sammankopplad med spottkällans vägg, vilket leder till att spottkällans inre utrymme förträngs/sluts, dock endast i dess bakre del bakom svalgets separation.

Fortfarande är golvet i salivariets bakre ände anslutet till en liten sned muskelgrupp (muskler som är knutna till salivariets golv, MS i fig. 2E,F,J,N, markerade med ljusblått) som är sammanfogade i de motsatta delarna med den övre delen av svalgets framsida. Dessa muskler gör det möjligt för den bakre delen av salivbotten att röra sig uppåt och nedåt. Dessa muskler har beskrivits hos honan I. holocyclus16. Möjligheten att salivbotten kan sänkas eller höjas har tidigare föreslagits i samband med snabba salivutgjutningar baserat på en registrering av elektriska signaler under uppstoppning av R. microplus och Dermacentor andersoni12,17,18,19,20. Under salivation hos R. microplus observerades snabba (upp till 30 per sek.) nedåtriktade avböjningar i konduktiviteten följt av större toppar i slutet av salivationen. En förklaring till dessa mätningar är sammandragningar av musklerna i den främre delen av svalget, tillsammans med en liknande pulsering av membranet över matningskanalen (hypostomal gutter) som öppnar en kanal för utstötning av saliven20. Vi antar att de små sneda musklerna som är knutna till salivbotten kan generera vibrationer som underlättar salivrörelsen. Även sidomuskler som påverkar diametern på salivariumets inre utrymme kan bidra till att saliven stöts ut ur munhålorna (ingår inte i animationen). Vi föreslår att chelicerae-rörelsen i värdshinnan också kan bidra till att saliven från salivariumet drivs ut i värdshinnan. Chelicerabaserna (ChB i fig. 2A,B) är belägna direkt ovanför salivarium (från dorsalvyn) och vi spekulerar i att dessa strukturer lokalt kan komprimera salivarium för att hjälpa till att driva ut saliven. Förlängningar av chelicerae, som var något asynkrona, observerades med hjälp av två-foton intravitalmikroskopi direkt på födosöksstället under hela perioden av I. scapularis engorgement21. Vi noterade att chelicerae började röra sig på ett något asynkront sätt efter applicering av pilokarpin på den dorsala kutikulan hos I. ricinus-honor som inte matats och delvis matats (film 5 respektive 6). De chelicerala baserna (ChB i fig. 2A,B) är belägna direkt ovanför salivariet (från dorsalvyn) och vi kan spekulera i att dessa strukturer kan expandera eller komprimera salivariet och hjälpa till att driva ut saliven. Det är välkänt att pilokarpin, ett kolinergiskt icke endogent läkemedel, kan framkalla salivation indirekt via fästingens centrala nervsystem22 , medan dess effekt på andra vävnader hos fästingar fortfarande är oklar. Därför kan vi inte utesluta den pilocarpinmedierade rörelsen av chelicerae i våra experiment som en ytterligare effekt av detta läkemedel hos fästingar. Bockenstedt et al. föreslog att chelicerae tvingar tillbaka kollagenfibrer som kan komprimera födosöksstället, vilket i hög grad bekräftar våra hypoteser om att chelicerae medierar utstötning av saliv till värddjuret21.

Kurtigt innan salivhålan slutar, går parvisa salivkanaler in i dess laterala hörn12. Båda spottkanalerna är omslutna av ett vävnadsblad (TSD i fig. 2C,E,F,M,N, mörklila) som troligen flexibelt fäster spottkanalerna vid salivariumets sidohörn.

Simulering av salivation och blodsugning baserad på 3D-modellen

Under födosöksförloppet hos ixodida fästingar alternerar salivationen med antingen långsam eller snabb blodsugning och kan inkludera en period av vila. Procentandelar av den tid som spenderas med varje aktivitet under honans svullnad är varierande och baseras på tid på dagen, storleken på fästingarna, etc.18. I film 4 animerade vi både födokanalen och kanalen för passage av saliv med tillhörande strukturer och visar hur dessa strukturer fungerar. Matningsprocessen hos de flesta ixodida fästingar börjar med utsöndring av cementliknande substanser, vilket gör att fästingen kan fixeras i värdens hud och förseglar gapet mellan matningsskadan och de insatta mundelarna23,24,25. Salivationsperioden kan avslutas med ett kort utbrott av saliv16,17,18,19. Utstötningen av saliv underlättas troligen av vibrationer i den bakre delen av salivariumgolvet; rörelser i cheliceralbasen kan också spela in (Movie 6). Innan blodsugningen börjar förträngs öppningen i den bakre delen av salivarium av de laterala musklerna som sträcks ut mellan salivariumtaket och fästingkroppens sidovägg. Denna åtgärd följs av öppnandet av svalgklaffen och en expansion av det främre svalget som orsakas av sammandragning av de främre dilatatormusklerna. Därefter sträcks den mellersta delen av svalget ut längs dess längdaxel och blodet dras in i svalget. Den främre svalgklaffen stängs innan svalgväggen dras ihop igen och blodet pressas bakåt till matstrupen. Denna peristaltiska våg upprepas tills salivationen börjar. I början av salivationen slappnar de laterala restriktormusklerna i salivrummet av, vilket gör att salivrummets hålrum förstoras. Upprepade sänkningar och höjningar av salivariets tak i dess bakre del underlättar troligen salivtillförseln till den pre-orala kanalen.